Nature：哈佛科学家体外培养大脑类器官重现大脑皮层的细胞多样性 | 单细胞专题

类器官（Organoid）是一种由不同类型干细胞通过自组织方式制备，实现模拟原生器官结构和功能的三维“微器官模型”。借助类器官，研究人员可深入观察人体组织的变化，更好地理解发育过程，并可用于再生医学以及药物的疗效筛选。有人说过，在已知的宇宙中，人类的大脑是最复杂的东西，没有之一。近年来，脑类器官的研究进展迅速，已成为脑科学研究的重要领域。顶尖学术期刊《Nature》上的一篇论文中，哈佛大学和Broad研究所Stanley精神病学研究中心的科学家们带来一项技术突破，将为理解复杂的人脑和治疗神经疾病打开新的大门。下面就让我们一起来详细了解一下：

论文标题：Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex

刊登日期：2019年06月

发表期刊：Nature

影响因子：69.504

研究机构：哈佛大学(Harvard University)和布罗德研究所(Broad Institute)斯坦利精神病学研究中心(Stanley Center for Psychiatric Research)

技术手段：scRNA-seq

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-019-1289-x

本论文介绍了作者新开发的一种大脑类器官培养技术：用人类干细胞在培养皿中培育出遵循大脑皮层的发育顺序，依次产生包含多个类型的细胞的大脑类器官，这为理解人类的大脑发育过程和治疗大脑疾病提供新的工具。

作者首先从同一个人类诱导多能干（iPS）细胞系PGP116衍生出四个模型的培养物。不同模型的整体外部形态和大小有很大的差异（图1a）。自我发育的全脑类器官显示出最大的形状变化。背侧和腹侧前脑球状体模型显示出更一致的形状，但仍然大大缩小。然而，背侧前脑类器官模型显示出大尺寸和整体形状一致的理想特征（图1a，b）。随后作者选用背侧前脑类器官进行了单细胞转录组测序和分析。

图1 不同培养方案生成的组织细胞和球状体的比较

作者采用10x Genomics平台，对诱导时间为3个月和6个月的21个大脑类器官(brain organoids)的166242个单细胞进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)。

图2 实验流程

测序数据：

建库：Chromium Single Cell 3 Library  Gel Bead Kit v.2 (10x Genomics, PN-120237)，

测序：NextSeq 500 instrument (Illumina)

测序数据：GSE129519

使用10X Genomics Cell Ranger 2.0.1 pipeline将reads比对到GRCh38人类参考基因组。除了–cells参数，其他参数都使用默认设置，得到相关的细胞-基因计数矩阵。单细胞测序数据统计结果如下表：

表1 scRNA-seq数据统计

主要研究内容：

1.t-SNE聚类和降维

首先作者对来自3个月大的大脑类器官进行了免疫组化染色，结果显示，当背侧祖细胞排列在脑室样腔内时，一个月大类器官存在莲座状结构。皮质锥体神经元亚型在两个月后逐渐形成，随后保持不变（图3c和图1b）。接下来作者对3个月大的大脑类器的78379个单细胞进行聚类分析，然后根据之前的数据集来定义细胞类型，识别出11种细胞类型，使用t-SNE聚类法在二维空间中进行了可视化绘图（图3d）。

图3 培养了3个月的脑器官产生了人类大脑皮层的细胞多样性，器官之间具有高度的可重复性

随后，作者对来自6个月的大脑类器官的87863个单细胞进行同样的分析，识别出13种细胞类型。

图4 培养了6个月的大脑器官显示出皮层细胞多样性的增加，同时保持了器官间的高可重复性

从上述结果可以看出，不同批次和不同类型干细胞产生的类器官有着相似的细胞类型。

2. 拟时序分析

作者为了研究相同的细胞类型是否是通过不同的发育轨迹产生的，使用Monocle package v.2.99.1对大脑类器官的单细胞进行了拟时序分析，发现这些细胞的产生遵循精确和可复制的轨迹，每个类器官沿伪时间轨迹呈相似分布，与品系或批次无关，在转录上类似于人类胎儿的大脑皮层细胞（图5a,b）。在三个月时，所有的组织胚胎都遵循着从放射状胶质细胞到成熟的兴奋性神经元的发展轨迹。为了证实神经元的成熟，突触前和突触后标记物VGLUT1和PSD95的共同定位表明在这个时间点存在兴奋性突触。在六个月时，轨迹沿着两个分支进行--走向兴奋性神经元或成熟星形胶质细胞（图5c）。这些数据表明，除了终端细胞组成外，每个类器官的命运发展轨迹是可重复建立的，表明这个类器官系统是可信的。

为了评估类器官细胞类型与内源性人脑细胞的相似性，作者使用了已发表的人类胎儿大脑皮层的scRNA-seq数据集，应用随机森林分类法将类器官细胞分配到人类皮层细胞类别。三个月和六个月的类器官细胞主要被分配到相应的内源性细胞类别，表明它们的转录表达谱与内源性细胞相似（图5d）。此外，所有背侧类器官和全脑器官都显示出与人类大脑皮层细胞的高相关性（图5e）。

图5 器官细胞按照精确和可重复的轨迹生成，在转录水平上与人类胎儿大脑皮层的细胞相似

3.可重复性评分

作者再次使用了t-SNE降维聚类法对人类和小鼠多个大脑皮层的scRNA-seq数据集进行重新分类，并计算了每个数据集的聚类分配和样本之间的相互信息（MI）分数（图6a-e）；较低的MI分数和较低的Z分数表明个体之间的可重复性较高。对于全脑类器官模型，这些类器官的MI得分很高，为0.27，Z分数为156.4（图6b）。相反，背部前脑类器官中的重现性一直很高，MI和z-cores（MI，0.049-0.089；z-core，38.0-75.7）均较低（图6a）。值得注意的是，在单个背部前脑类器官中产生不同集群的可重复性（图6a）与单个内源性人类或小鼠大脑样品（MI范围，0.008-0.064；z-core范围2.2-41.4）相当（图6c-e）。所有的数据集，包括人类和小鼠的内源性大脑，都显示出样品之间的差异；然而，背部前脑类器官样品的差异程度与内源性大脑数据集的差异相似。

图6 背部前脑类器官显示出与内源性大脑类似的样品间可重复性

总结

该研究使用大脑类器官的大量scRNA-seq数据集，证明了复杂的中枢神经系统区域的广泛的细胞多样性可以在胚胎之外以高度可重复和限制发展的方式产生，超越了单个器官、实验批次、遗传背景和性别。这些数据表明，发育的动态过程可以在器官中进行模拟，大脑区域的早期模式化是一个有规律的发展过程，即使在胚胎之外也是高度受限的。这种体外的可重复性使我们了解到控制人脑细胞多样化的基本约束和原则，并建立了一个有价值的类器官模型，可用于研究与人类神经疾病有关的发育异常情况。

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