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单细胞多组学专题：Nature medicine揭示新辅助化疗对乳腺癌的潜在作用机制
期刊名称：Nature medicine
影响因子：87.241发表时间：2021所用组学：scRNA-seq、RNA-seq和CITE-seq
一、研究背景
三阴性乳腺癌（TNBC）是一种与不良预后相关的异质性肿瘤，占所有乳腺癌（BC）患者的15%。在所有BC亚型中，TNBC表现出最多的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），免疫检查点封锁（ICB）联合新辅助化疗可有效改善乳腺癌的病理进程。然而，并非所有BC患者对新辅助ICB都有反应。因此，确定哪些潜在的作用机制和相关的标记物决定治疗反应是亟需解决的问题。
二、实验设计
队列1：第一组非转移性、未经治疗的原发性浸润性乳腺癌患者在术前约9±2天接受了一剂量的Keytruda或抗PD1治疗；队列2：第二组患者接受了为期20-24周的新辅助化疗，术前随后使用派姆单抗。在两个队列中，在抗PD1治疗前立即（“治疗前”）收集一个肿瘤活检，而在随后的手术中收集另一个活检（“治疗中”）。
三、研究结果
SINGLE CELL
·1、在抗PD1治疗前和治疗期间的单细胞图谱·
首先，通过对队列1进行分析，一共鉴定到恶性乳腺上皮细胞、免疫细胞、内皮细胞和成纤维细胞（图1b）。作者证实了恶性乳腺上皮细胞簇拷贝数不稳定的，而其他细胞群，包括成纤维细胞，拷贝数相对稳定。恶性细胞簇具有患者特异性，而非恶性细胞簇则存在于所有患者之间。治疗前和治疗中活检或不同BC亚型没有聚类偏倚。Tips：上图可通过联川星云进行绘制作者使用scTCR-seq在51499个T细胞中基于共享的TCR序列来定义克隆型。>2细胞（n=12531）或>5细胞（n=7793）作为克隆阈值，充分考虑了具有共享序列的T细胞。这确定了9例在两个阈值上和治疗前均出现克隆型扩张的患者（图1c）。当考虑克隆型比例时，相同的患者也表现出克隆型扩增。作者将这些患者指定为克隆型扩增或“E(s)”患者。其他患者则被定义为“NE(s)”。一些克隆型在治疗后也消失了，这表明T细胞经历了“克隆型收缩”。但克隆型收缩不如克隆型扩增明显。
SINGLE CELL
·2、表达PD1的T细胞在抗PD1处理后增殖·
接下来，作者分析了T细胞扩增（E与NE）和治疗（治疗前与治疗后）分层时的scRNA-seq数据。预处理后，成纤维细胞在NEs中更常见，而T细胞在Es中更常见（图1d）。在治疗中，癌细胞和成纤维细胞在NEs中更常见，而T细胞在Es中进一步富集。事实上，通过免疫组化或scRNA-seq测定的基质TILs的百分比在治疗后增加了。SINGLE CELL
·3、T细胞沿着CD8+ TEX细胞的轨迹扩张·
接下来，作者进行了拟时序分析。CD8+初始T细胞（TN细胞）的TCR丰富度最高，作者认为这是轨迹的根源。与其他研究相似，作者观察到三种不同的CD8+ T细胞轨迹（图2a）：TN与TEM细胞连接，TEM细胞分叉成三种不同的轨迹，形成TEX1和TEX2细胞、常驻记忆CD8+ T细胞（TRM）和活化效应/记忆T细胞（TEMRA细胞）。TCR丰富度沿着轨迹下降，克隆型通常在随后的T细胞表型之间共享（图2b）。RNA速度分析证实了这些轨迹，而标记基因的分析证实了它们的功能注释（图2c，d）。在治疗前和治疗后，TEX细胞比NEs在轨迹结束时更频繁（图2e）。Es在治疗时与治疗前时的差异更为明显。因此，来自Es处理后的TEX细胞具有更“显著的效应活性”和“短暂/早期衰竭”的特征。基于LAMP1的表达，CITE-seq证实了Es的细胞毒性增加。在NEs中，TEM细胞主要位于轨迹的中间，表明NEs中T细胞效应功能消融。在所有轨迹中，Es的TCR丰富度均低于NEs（图2e）。沿TRM和TEMRA轨迹，丰富度没有下降，而沿TEX轨迹，丰富度没有下降，尤其是在Es中。此外，与预处理相比，治疗时的下降更为明显，反映了抗PD1诱导的T细胞持续扩张。在Es中，细胞周期评分也沿着TEX轨迹增加，并且在预处理时更高，特别是在最后。最后，作者沿着轨迹发现了扩张和非扩张的T细胞（图2e）。这证实了扩张的TEX细胞在运动轨迹的末端富集，特别是在处理时。SINGLE CELL
·4、T细胞沿着CD4+TH1和TFH细胞的运动轨迹扩张·
在CD4+ T细胞（TREG除外）中，Slingshot检测到额外的表型异质性。TEX细胞分裂为1型辅助细胞（TH1）和滤泡辅助细胞（TFH）（图2f）。虽然免疫检查点标记物（PDCD1，CTLA4）在TH1和TFH细胞中均高表达，但它们的TH1-（IFNG，GZMB）和TFH特异性（BCL6，CXCR5）标记物的表达不同。标记基因和相关转录因子沿着轨迹的分析证实了它们的功能注释（图2i）。NEs中的TH1和TFH细胞在治疗前和治疗中均处于早期效应前/记忆状态（图2j）。相比之下，在Es中，它们都积累在轨迹的末端。因此，在Es处理后的TH1和TFH细胞中，T细胞活性和早期衰竭标志物的表达增加。TCR丰富度在轨迹结束时下降（图2j），特别是在来自Es的TH1细胞中，而在处理后的Es中，增殖在轨道结束时增加。当比较沿轨迹扩张和非扩张的CD4+ T细胞时，TH1和TFH细胞在轨迹的末端都被富集，特别是在处理后的Es中（图2j）。总的来说，这些数据表明TH1和TFH的轨迹在很大程度上促进了克隆型的扩张，这表明它们支持CD8+ TEX细胞的持续效应功能。SINGLE CELL
·5、T细胞扩张过程中基因表达的变化·
作者进一步沿着CD8+ TEX轨迹鉴定了5组差异表达基因（DEGs）。第一组由初始T细胞标记物（CCR7、LEF1）组成，沿着轨迹减少，而第两组（早期）激活基因（GZMK、GZMM、GZMA、NKG7）组成，在轨迹的中途增加，但随后减少。另外两组在轨迹结束时增加，具有效应（IFNG）、细胞毒性（GZMB、PRF1）、早期和全身衰竭（PDCD1、CTLA4、ENTPD1）标记物（图3a）。通路分析显示，Es中干扰素（IFN）反应上调，氧化磷酸化反应下调（图3c，d）。与CD8+ T细胞相似，NEs中RUNX3和CBFB减少，而Es中IFN-α/γ反应增加（图3f-h）。因此，沿着轨迹的基因表达谱确定了Es和NEs之间差异表达或激活的标记物或通路。SINGLE CELL
·6、T细胞的表达特征可以预测T细胞的扩张·
接下来，作者确定了扩张的T细胞和不扩张的T细胞之间的DEGs（图4a）。非扩张T细胞更naive(LEF1，SELL，TCF7)，而扩张T细胞表现出高效应功能(IFNG)，免疫细胞归巢信号(CXCL13，CCL3/4/5)，细胞毒性(GZMB，PRF1，NKG7)，抗原递呈(CD74，HLA-DRB1/5，HLA-DQA2)和免疫检查点标记物表达(PDCD1, HAVCR2, LAG3)。ENTPD1 (CD39)和ITGAE (CD103)标志着肿瘤反应性T细胞，在扩张的T细胞中也非常明显。扩大克隆型的数量也与这些基因的表达或其相关通路的治疗前相关。免疫检查点标记物和CD4+ TH1活性最能预测Es患者的T细胞扩增（图4b）。CITE-seq证实，NEs中的初始T细胞标记物高于Es，而免疫检查点、肿瘤反应性和共刺激标记物降低（图4c）。当比较Es与TNBC（n=5）和ER+ BC（n=3）时，扩增克隆型的数量没有差异。然而，预处理T细胞中PD1的表达和增殖的T细胞数量较高（图4d，e）。在TNBC治疗前，Es还表现出CD8+ T细胞效应功能基因、CD4+ TH1活性和免疫检查点基因的表达增加（图4f）。SINGLE CELL
·7、新辅助化疗和抗PD1治疗后的T细胞扩增·
进一步，作者分析了在抗PD1前接受新辅助化疗患者的治疗前和治疗中活检（n=11）样本的单细胞测序数据（队列2）。Es的T细胞和pDCs在处理时增加，而预处理时不增加，PD1的处理前和预处理时pDCs均增加（图4h-i）。T细胞的亚聚类证实了CD4+和CD8+ TEX细胞在Es中更为常见，无论是在治疗前和治疗后（图4j）。比较扩张和非扩张T细胞预处理，发现了与仅接受抗PD1的患者相似的DEGs或KEGG通路。同样的基因或途径也可以预测到T细胞的扩张。TH1活性和在TH1细胞中50个DEGs可靠地预测了T细胞的扩增，证实了当抗PD1联合新辅助化疗时，CD4+ TH1细胞也参与了T细胞的扩增。SINGLE CELL
·8、树突状细胞与T细胞扩张相关·
由于树突状细胞（DC）在调节CD8+ T细胞免疫和肿瘤抗原耐受之间的平衡中起着核心作用。作者发现一种MigDCs聚集在不同的亚群中：一个表达免疫调节分子的转录活性群体（mregDC26；PD-L1/L2）和一个表达迁移标记基因的静止群体（图5a）。与NEs相比，Es在DCs中PD-L1 (CD274)和PD-L2 (PDCD1LG2)升高（图5b）。免疫组化证实，在Es中，PD-L1水平均较高（图5c）。在DC亚型中，PD-L1由mregDCs唯一表达（图5d）。Es与NEs中预处理的DEGs显示IFN反应性(STAT127, IFI27, ISG20)、DC分化(ETV628)、抗原交叉呈递(HLA基因)和加工(LY7529, TAP130)以及T细胞共刺激(CD80)相关基因水平增加（图5f）。在Es治疗中，pDCs、ASDCs和mregDCs更为常见（图5e，g）。CXCL9和CXCL10对T细胞向肿瘤的迁移很重要，与IFN反应性和抗原提呈相关的基因在治疗后Es和NEs中升高（图5f）。CXCL9和CXCL10对T细胞向肿瘤的迁移很重要，与IFN反应性和抗原提呈相关的基因在治疗后Es和NEs中升高。SINGLE CELL
·9、表达PD-L1/L2的巨噬细胞与T细胞的扩增相关·
鉴于巨噬细胞也可以作为肿瘤免疫的介质，作者将7952个髓系细胞聚为10种表型，包括2个单核细胞(C1和C2)和8个巨噬细胞(C3-C10)簇（图5h）。与树突状细胞相似，巨噬细胞表达PD-L1和PD-L2。然而，巨噬细胞比树突状细胞更丰富。在治疗前的巨噬细胞中，Es中的PD-L1/L2明显高于NEs（图5b），而几种细胞因子(CXCL9, CXCL10, CCL8)和I/II型IFN反应基因上调（图5i）。相反，CX3CR1和C3下调。CITE-seq证实，与NEs预处理相比，Es共刺激标志物的表达增加（图5j）。在亚簇水平上，大多数巨噬细胞表型表达PD-L1（图5k）。Es预处理时，C7_CX3CR1巨噬细胞减少，治疗后这种影响更加明显（图5i）。相比之下，C3_CCR2巨噬细胞，基于M1标记物表达的促炎巨噬细胞(CXCL9/10, SOCS3)，在治疗时Es富集（图5i）。SINGLE CELL
·10、在T细胞扩张的肿瘤中，癌细胞受到抗PD1的影响·
由于T细胞的活性依赖于癌细胞的肿瘤抗原呈递，作者也研究了癌细胞（图6a）。虽然作者未能在癌细胞中检测到PD-L1，但作者观察到许多抗原呈递主要组织相容性复合体(MHC) I/II类基因在NEs和Es中下调（图6b，c）。与NEs预处理相比，与抗原处理或呈递相关的信号通路和IFN-γ反应信号通路均上调。通过Es治疗前和治疗后的数据比较，证实了持续的抗肿瘤免疫反应，在Es治疗后的癌细胞中富集了细胞增殖、蛋白质水解、细胞死亡、免疫信号通路和细胞毒性途径。SINGLE CELL
·11、与T细胞扩张相关的免疫环境·
最后，作者还探讨了哪些细胞类型和表型与T细胞的扩增相关。CD4+或CD8+ TEX细胞、增殖T细胞、migDCs、表达PD-L1的巨噬细胞表型，包括CCR2+和MMP9+巨噬细胞的相对频率与T细胞扩增呈正相关。相比之下，初始T细胞或效应/记忆T细胞与抑制性（CX3CR1+）巨噬细胞呈负相关（图6e）。同样，T细胞中PD1的表达、巨噬细胞中PD-L1/2表达、癌细胞中MHCI/II类基因和T细胞克隆性与T细胞扩增呈正相关，而T细胞中TCF7和SELL、巨噬细胞中CX3CR1和C3在巨噬细胞中的表达呈负相关。作者还使用CellphoneDB预测了受体-配体的相互作用。首先，作者分别计算了Es和NEs的细胞类型之间的相互作用。观察到Es比NEs预处理有更多的相互作用可能性，特别是在癌细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞和T细胞之间（图6f）。CD8+或CD4+ T细胞与其他免疫细胞之间的特异性相互作用包括共刺激（CD28-CD80、ICOS-ICOSLG）或共抑制（PDCD1-CD274/PDCD1LG2（PD1-PD-L1/2）、HAVCR2-LGALS9（TIM3-Galectin9）、CTLA4-CD80/CD86）相互作用（图6g，h）。相比之下，在NEs预处理中，CD8+ T细胞表现出与髓系细胞的抑制相互作用，与单核/巨噬细胞和癌细胞的促凋亡相互作用，而T细胞的归巢相互作用缺乏（图6g）。在治疗过程中，作者观察到Es中癌细胞与其他细胞类型之间的相互作用数量显著减少。在癌细胞和CD8+ T细胞之间，在Es（CXCL10_CXCR3，ICAM1_LFA1）中观察到一些新的相互作用，而在CD8+ T细胞和树突状细胞之间发现了共刺激相互作用（TNFRSF9-TNFSF9）。总的来说，这些数据描述了治疗前活检中与抗PD1治疗后T细胞扩增相关的交互式免疫环境。往期精彩公告
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