单细胞多组学专题：Cell揭示肝巨噬细胞生态位 | 单细胞专题

期刊名称：Cell

影响因子：66.85

发表时间：2022

所用组学：scRNA-seq、snRNA-seq、CITE-Seq和ST RNA-seq

01研究背景

单细胞转录组学的快速发展使人们能够更好地了解不同物种不同器官的细胞组成。然而，关于这些细胞是如何在独特的微环境生态位中组织起来的信息解析的仍然不够全面。非实质肝细胞的空间组织信息仍探究的不够清晰，大多数肝细胞的来源及精确定位都是未知的。此外，转录组和蛋白组之间的关联也没有被解析的十分清晰，导致缺乏可靠的表面标记物通过流式细胞仪和共聚焦显微镜来识别这些细胞。

02实验设计

两种消化策略

消化策略1：体外消化+单细胞测序；

消化策略2：体内消化+单细胞测序；

并与单核转录组数据进行了对比。

空间转录组测序

人和小鼠肝脏组织样本进行空间转录组测序

单细胞测序

人、小鼠样本进行单细胞和单核转录组测序；

猕猴、猪、仓鼠、鸡、斑马鱼的肝脏组织采用单细胞转录组测序。

03研究结果

01
小鼠肝脏蛋白质基因组图谱

首先，为了研究单细胞分辨率下的mRNA和蛋白的表达，作者使用了CITE-seq，并用 107-161 寡核苷酸偶联抗体对样本进行染色（图1A）。聚类分析结果表明一共鉴定到了17种细胞类型。在CITE-seq分析中添加抗体，可以识别所有细胞的表面标记物，包括Kupffer细胞（KCs）的VSIG4和FOLR2，而不影响转录组数据的质量（图2D）。且有研究报道称Kupffer细胞包含KC1和KC2两个子集，且CD206和ESAM作为KC2的标记物主要由肝窦内皮细胞（LSECs）表达。

02
肝髓系细胞亚群空间定向特征

为了定位所鉴定的细胞，作者从两个不同的方向切割肝脏，以描绘肝组织和包膜的空间转录组特征（图1C）。作者沿着空间轨迹对每个Visium点进行排序，并根据已知的肝细胞分区肝门、门管周带、中部地带、中央区进行了标记。通过反卷积的方法将 sc/snRNA-seq 细胞鉴定结果映射到空间层面上，并研究了细胞占比如何随分区而改变（图1F，G）。结果表明，胆管细胞特异性地定位于门脉区，而KCs优先定位于肝门和中部地带。虽然KC的位置是分带的，但作者在KC的基因表达谱中没有发现很强的分带模式。进一步作者发现在门静脉（PV）中发现了传统树突状细胞（cDC）（图1F，G）。

接下来，为了在单细胞分辨率上验证这些位置信息，作者筛选了最佳的细胞特异性表面标记物。为了同时筛选多种抗体，作者进行了第二次Visium分析，根据CITE-seq结果选择了100个寡聚偶联抗体（图1H）。然后使用MACSima™ Imaging Cyclic Staining（MICS）技术和60种抗体组合，在单细胞分辨率下筛选哪些抗体在空间位置上起作用（图1I）。通过对Xcr1、Clec9a（cDC1s）和Cd209a、Mgl2和Clec10a（cDC2s）的表达，作者证实了cDC1s和cDC2s都主要定位于PV（图1J）。作者通过开发一种将mRNA检测（RNAScope）与表面蛋白检测相结合的方案。通过检测cDC或mac特异性mRNA与蛋白表面标记物结合的表达，证实了PV cDC1、cDC2s和非KC macs的存在（图1K）。

图1：健康小鼠肝脏的蛋白质基因组图谱

Tips：上图D可通过联川星云进行绘制

03
骨髓细胞的精细分析确定了肝巨噬细胞的三个亚群

接下来，作者对sc/snRNA-seq数据中髓系细胞数据进行了分析（图2A-C）。通过差异表达基因（DEGs）对髓系细胞进行了分析时发现，可将簇6定义为腹脂巨噬细胞（图2B）；簇7为包膜巨噬细胞；将表达Cd207和Cx3cr1，簇8定义为Gpnmb+Spp1+脂质相关巨噬细胞（LAMs）（图2A-D）。然而，虽然分子图谱证实了包膜中存在Cd207+ 巨噬细胞，但在CV中也发现了Cd207+ 巨噬细胞，而在PV中很少发现。因此，簇7由包膜和CV CD207+ 巨噬细胞组成。

图2：健康小鼠肝脏胆管周围存在巨噬细胞群

Tips：上图A、B、C可通过联川星云进行绘制

04
KCs和LAMs在稳态小鼠肝脏中具有不同的功能

接下来，作者探究了KCs和LAMs之间的差异。GO富集分析表明，KCs可能在调节体液反应中发挥作用，而LAMs更广泛地与免疫反应相关（图2I和J）。与此相一致的是，在100倍蛋白显微镜数据中，作者观察到相当大一部分B细胞与KCs相互作用，而在T细胞中并没有观察到（图2K）。这表明这两个细胞群之间存在交叉作用，可能与小鼠KCs高表达B细胞趋化因子Cxcl13有关。为了进一步评估LAMs与KCs相比的炎症性质，作者采用FACS纯化细胞，并进行qPCR分析来检测各种细胞因子的表达。结果表明LAMs在稳态下比KCs表达更多的Il1b（图2L）。然而，尽管如此，在体内TLR4刺激下，它们在促炎细胞因子和抗炎细胞因子方面的反应都不如KCs（图2L），这可能表明了LPS耐受性。

 图2：健康小鼠肝脏胆管周围存在巨噬细胞群

Tips：上图I、J可通过联川星云进行绘制

05
巨噬细胞亚群位于不同的空间生态位中

由于所有巨噬细胞群都与局部环境中的CD45-细胞密切接触，因此作者进一步分析了CD45-细胞，鉴定出多个ECs和SCs亚群（图3A-C）。ECs被鉴定出包含ECs（cluster 10）、LSECs（cluster 9）、PV ECs（cluster 11）和淋巴ECs（LEC；cluster 12）共4个不同的亚群。由于Visium在PV和CV中都发现了成纤维细胞（图3D），并且之前的研究表明这些细胞中存在不同的亚群，因此作者进一步分析了SCs，以更好地评估它们的异质性。结果表明间皮细胞和成纤维细胞的亚群存在于囊内（图3H）。此外作者鉴定了一个Clic5+Reln+成纤维细胞的亚群（簇3），它们位于胆管细胞周围（图3J）。综上所述，这些空间上不同的ECs和SCs亚群的存在突出了不同巨噬细胞群所定植的特定微环境的独特性。

图3：肝巨噬细胞群位于不同的生态位

Tips：上图A、B、C、F、G、H可通过联川星云进行绘制

06
健康人体肝脏的蛋白质基因组图谱

为了确定巨噬细胞亚群之间的保守程度以及小鼠和人类肝脏之间的不同微环境生态位，作者接下来使用sc/snRNA-seq和CITE-seq对19例肝脏活组织检查生成了人类肝脏的蛋白质基因组图谱，并使用Visium确定空间信息（图4）。鉴定的细胞类型和区域与小鼠基本一致。

图4：健康人肝脏的蛋白质基因组图谱

Tips：上图B可通过联川星云进行绘制

07
进化保守的KCs转录组和蛋白质组特征

到目前为止，还没有真正的人类KCs的有效标记物被描述出来。作者发现单核细胞和巨噬细胞在人类sc/snRNA-seq数据中形成了一个单一的连续体，阻碍了对人类KCs的研究。由于在人类肝脏中存在这样一个连续体表明，在健康人类肝脏中，单核细胞可能对KCs也有贡献。通过对KCs基因的表达情况进行分析，鉴定出cluster10为真正的人类KCs。空间定位分析发现人与小鼠的定位不同，人的KCs定位于中间区域（Mid）。为了进一步评估KCs在进化中是否具有保守，作者对猕猴、猪、仓鼠、鸡、斑马鱼的肝脏样本也进行单细胞测序，发现在上诉物种中均鉴定到了KCs（图4D）。

08
LAM在脂肪肝中的空间定位发生改变

除了KCs，作者还在人类髓系细胞中发现了不同的巨噬细胞簇，并分析了LAMs细胞异质性。该研究在肝囊中发现了CD68+VSIG4-巨噬细胞，靠近中央和PV以及胆管（BDs）（图5A-C）。在健康猕猴肝脏也发现了类似的现象。与健康小鼠一样，Visium在非脂肪变性肝脏的门脉区发现了人类LAMs。然而，在脂肪变性的人类肝脏中，LAMs主要位于中心周围（图5E），这表明单核细胞被招募到健康和肥胖肝脏的不同位置，然后在那里分化成LAMs。

图5：健康和肥胖的肝脏LAM空间定位分析

09
CD45-肝细胞在确定巨噬细胞定位中的潜在作用

由于KCs在健康小鼠与人类肝脏中以及LAMs在小鼠和人类健康肝脏与脂肪变性肝脏中的定位改变，作者接下来试图研究巨噬细胞生态位在微环境下的差异。在对人肝脏中CD45细胞的分析发现，在健康小鼠肝脏中观察到类似的ECs、SCs和肝细胞群（图6A）。在鉴定的CD45-细胞的定位方面没有发现显著差异，这可以解释与小鼠相比KCs位置的改变（图6C和D）。因此，作者采用了细胞互作分析来探究潜在的配体-受体对如何调节KCs的位置。该分析发现，LSECs表达CCL23和CCL14，肝细胞表达CCL16，与人KCs表达的CCR1结合，而不是小鼠KCs（图6E）。这些配体优先位于中心的位置（图6F），因此为进一步研究KCs在人类肝脏中位置的潜在调控提供了靶点。

作者接下来探究了CD45-细胞在健康和脂肪变性肝脏中调节LAM位置的作用。结果表明在人成纤维细胞中CCL2和Cd44的高表达（表S3），可能在招募胆管导LAMs中发挥重要作用。

图6：CD45-肝细胞与巨噬细胞的相互作用

Tips：上图A、B、E、G、H可通过联川星云进行绘制

10
NicheNet分析揭示了ALK1-BMP9/10轴在KCs发育中的关键作用

进一步的，作者探究了CD45-细胞在调节细胞表型中的作用。NicheNet分析揭示了LAM很少有特定的配体-受体对，提示局部因素，如代谢物，而不是独特的细胞-细胞相互作用可能驱动LAM表型。与此一致，用乙酰化低密度脂蛋白培养的BM单核细胞表达LAM相关基因（图7A），表明脂类在诱导LAM表型中起主导作用。相反，对于KCs，作者发现在人类和小鼠之间有多个配体受体对是保守的（图7B）。且KCs（ALK1）和星状细胞（BMP9/10）之间的ALK1-BMP9/10信号在7个物种中都是保守的，并且可能会控制其他保守的KC基因表达。并通过基因敲除实验进行了验证。总之，这验证了NicheNet的预测，并证明了进化上保守的ALK1-BMP9/10轴对KCs的发展和维持的重要作用。

图7：ALK1-BMP9/10信号调节KCs发育

Tips：上图B、C可通过联川星云进行绘制

关于联川

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