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还在玩ceRNA机制？细胞核内lncRNA与DNA互作影响转录因子及下游基因表达 | lncRNA专题
论文标题：LETR1 is a lymphatic endothelial-specific lncRNA governing cell proliferation and migration through KLF4 and SEMA3C
刊登日期：2021-02-10
发表杂志：Nature communications
影响因子：17.694
研究机构：Swiss Federal Institute of Technology
文献地址：10.1038/s41467-021-21217-0
前言
结果
1
鉴定血管谱系特异性 lncRNA
首先作者通过qPCR对LEC和BEC进行了鉴定，随后通过RNA-Seq 和 CAGE-Seq对LEC和BEC进行测序，并且引入了新生儿原代真皮成纤维细胞（DF）的数据。通过两两比较，并取交集得到了142个LEC和160个BEC特异性lncRNA（图1a-d）。随后通过注释工具对这些特异性IncRNA进行分类，发现在lncRNA中占比最大的是基因间lncRNA（图1e-f）。2
通过ASOs鉴定lncRNA的候选功能
接下来作者首先筛选出有保守转录起始区域和外显子区域的lncRNA，随后筛选出TSS和DHS重叠的lncRNA，最后通过RNA-Seq和CAGE-Seq中的表达水平进行筛选，一共鉴定出5个LEC和12个BEC lncRNA。作者选择了2个LEC IncRNA（AL583785.1和LETR1）和 2个BEC lncRNA（LINC00973 和 LINC01013）（图2a-c）。通过qPCR检测发现婴儿和成人皮肤样本的LEC和BEC之间存在差异表达（图2d、e）。使用流式细胞术分选人类健康皮肤中的LEC和BEC，并用qPCR分析了四种候选lncRNA和特定血液和淋巴标志物在LEC和BEC中的表达水平，发现两种EC和两种BEC lncRNA在各自的细胞类型中有更高的表达量（图2f、g）。通过细胞分级分离法和qPCR分析了这四种IncRNA在LEC和BEC中的亚细胞定位，AL583785.1在细胞质和细胞核之间几乎均匀分布，而LETR1、LINC00973 和 LINC01013 都主要位于细胞核中（图2h、i）。lncRNLETR1-ASOKD后的转录谱显示了LETR1在细胞生长、细胞周期进程和迁移中的潜在功能
作者通过敲低4种IncRNA后再进行CAGE-Seq，发现LEC中AL583785.1和BEC中LINC00973和LINC01013的ASO 敲低后基因表达的变化不明显。而敲低LETR1之后对LEC转录组有很大的影响，导致133个基因上调和122个基因下调。通过GO分析发现上调基因主要参与细胞死亡、炎症信号传导和对外部刺激的反应，而下调基因主要与细胞迁移和趋化性的调节有关（图3a-d）。通过基序活性响应分析，发现了 19 个上调和 7 个下调的基序。基于 MARA 分析，接下来又用255个受LETR1-ASOKD影响的基因重建了一个基因调控网络，发现了与内皮细胞增殖和迁移相关的基因，如VEGFA、MAFF、ANGPT2、RASD1、PROX1、SEMA3C和ROBO1（图3e、f）。这些结果表明，LETR1敲低后影响TF调控网络从而对LEC的转录组产生重大影响，这些靶向基因都是些内皮细胞分化、增殖和迁移的必需基因。4
LETR1是在LEC中表达三个主要转录本中真正的lncRNA
作者对LETR1的潜在编码特性进行研究。根据数据库得到，LETR1转录19种不同的外显子组合。通过CPAT和PhyloCSF证实了这19种转录变体都是非编码性质的。通过3 ' RACE对LEC中的LETR1的亚型进行表征，鉴定得到三个LETR1的转录本，经证实，所有三种转录本都不能产生任何蛋白。通过qPCR对三个LETR1转录本的表达分析显示 LETR1-1是LEC中最具代表性（图4a-f）。5
敲除LETR1会降低LEC细胞生长、细胞周期进程和细胞迁移
为了研究LETR1-ASOKD对LEC生长的潜在影响，作者通过动态成像分析进行了细胞生长测定，发现LETR1-ASOKD抑制了LEC的细胞生长。同时为了研究细胞生长表型是否不是由于ASOs的脱靶效应造成，作者还进行了CRISPR敲低后的细胞生长测定，发现LETR1的CRISPRi-KD也显著降低了LECs的生长速度。然而，由于敲除效率较低，其作用不如ASOKD显著（图5a、b）。通过流式细胞术发现LETR1-ASOKD后在G0时期中的LEC的百分比显著增加（图5c、d）。通过创面闭合实验（划痕实验）发现LETR1-ASOKD的LEC迁移显著减少（图5e、f）。慢病毒过表达LETR1，发现可以缓解敲低LETR1所引起的细胞增殖和迁移的抑制（图5g、h）。6
LETR1是一个核lncRNA，与差异表达基因子集附近的DNA区域反式相互作用
在培养的LEC中进行了RNA荧光原位杂交，发现LETR1主要定位在培养的LEC的细胞核中，这表明LETR1可能在体内发挥染色质相关功能（图6a、b）。随后作者又进行了Pull down实验，并对DNA进行测序，发现LETR1有2258个结合位点，为了鉴定由LETR1直接调控的候选基因，分析了LETR1结合位点的基因组分布。得到 1607个蛋白质编码基因，这些基因在其启动子、外显子或内含子中至少有一个LETR1结合位点。其中有1193个基因在LEC中表达，随后与LETR1-ASOKD上的 255个差异基因取交集，一共得到44个基因（12个上调和 32个下调）。并且这44个基因在不同的染色体上，表明LETR1具有主要的反式调节作用。44个基因其中29个在LEC中表达下调基因但在BEC中表达上调基因，暗示这些基因是LETR1的潜在下游靶基因（图6c、d）。使用MEME分析确定了两个显著富集的基序，表明LETR1与基因组 DNA 的相互作用可能通过不同的 DNA 基序发生。通过比较基序分析发现LETR1基序与之前MARA鉴定的几个TF结合位点有显著的相似性（图6E、F）。结果显示，LETR1通过影响的TF调控网络从而成为调控LEC转录组的关键因子。
7
LETR1通过KLF4和SEMA3C调节细胞增殖和迁移
在LETR1的44个下游靶基因中，作者将重点研究KLF4、SEMA3C。其中KLF4与细胞增殖相关，SEMA3C与增强内皮细胞的迁移相关。LETR1-ASO2敲低导致KLF4上调，同时在G0时期LEC增加。LETR1和KLF4同时敲低可以g0时期LEC减少，但是这种作用有一定的限度（图7b、c）。随后又分析了LETR1敲低，但SEMA3C过表达对LEC的迁移的改变。发现单独敲低 LETR1会导致 SEMA3C下调，细胞的迁移减少。但在LETR1敲低后，又使SEMA3C过表达发现细胞迁移能力显著恢复，而单独的SEMA3C过表达不影响LEC的细胞迁移能力（图7d、e）。8
LETR1 与几种蛋白质复合物相互作用以发挥其转录调节功能
作者通过pull down和质谱分析有哪些可能与LETR1相互作用的蛋白质，通过筛选一共发现59个蛋白质与LETR1有相互作用关系，这59个蛋白质中有很大一部分与RNA处理功能有关（图8a）。随后分析了59种与LETR1相互作用的蛋白在LEC与BEC中的RNA表达。发现了四个蛋白质（DDX39A、NUMA1、RBBP7和DDX5）（图8b）。其中作者对组蛋白结合蛋白RBBP7比较感兴趣，因为之前的研究发现它参与了许多细胞功能的调节，包括增殖和迁移。于是通过RNA免疫沉淀实验发现了RBBP7和LETR1之间的相互作用，表明RBBP7是LETR1基因调节功能的媒介。作者在LETR1敲低样本中分析了RBBP7在KLF4和SEMA3C的TSS以及LETR1结合位点的富集量，发现LETR1的敲低显著降低了KLF4和SEMA3C启动子处的RBBP7和RNA Pol II的富集量。但只降低了KLF4中LETR1结合位点处RBBP7的富集量，并且在之前的研究中作者发现LETR1与靶基因组区域的结合可能涉及三链体形成，所以这里的降低可能是有三链体导致（图8g、h）。在组蛋白修饰水平上，敲低LETR1 仅影响 H3K4me3 修饰，尤其是在SEMA3C的TSS。然而，在LETR1-ASO2 敲低后，H3K27me3 水平没有改变（图8i、j）。综上所述，这些结果表明，LETR1通过RBBP7介导RNA Pol II的富集，并在一定程度上介导靶基因转录位点的染色质组织，从而发挥转录调控作用。结果本研究通过RNA-Seq和CAGE-Seq确定了人类真皮淋巴和血管内皮细胞中特异性lncRNA的图谱，并通过LETR1的功能表征强调了lncRNA在调节特异性内皮细胞功能方面的重要性。关于联川
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