轻松唤醒沉睡样本库！多个FFPE样本实例证明VITA产品性能优异，让你选择无忧 | 单细胞专题
The following article is from M20 Genomics Author 市场部
要通过单细胞技术唤醒沉睡的样本库，FFPE样本制备、样本准备、核酸质检、样本解离都非常重要。
FFPE样本制备
01
样本采集
组织固定前的操作时间应当越短越好，以避免基因表达改变、组织自溶等变化；
02福尔马林固定
组织的固定使用的是福尔马林溶液。将组织放到一定浓度的福尔马林溶液中，使核酸之间、蛋白质之间、以及核酸和蛋白质之间产生一定程度的交联,固定时间越长，交联程度越大；
03石蜡包埋
福尔马林固定之后，需要用石蜡将组织进行包埋，其包括四个主要步骤：脱水，透明，浸蜡和包埋在固定和包埋之后，FFPE样品最好应在最佳温度下保存，这样可减缓核酸和蛋白的降解；
04样本保存
在固定和包埋之后，FFPE样品建议在最佳温度下保存，这样可减缓核酸和蛋白的降解。在一个比较不同保存温度的实验中，发现如果FFPE样品保存在4°C，而不是室温或更高，则RNA在1年后仍基本完整。
FFPE样本准备要求
FFPE样本保存时间建议在1年内。为了获取足够的细胞数量，优先选择石蜡块，如果不方便寄送石蜡块，可以选择手工切取的蜡卷或者切片。样本要求量一般来讲需满足：（1）石蜡块：蜡块被包埋组织体积需要>0.5cm3（2）石蜡卷/切片：所用蜡块被包埋组织横截面积需>0.3 cm2 ，可切石蜡卷2-3卷，每卷厚度>50μm。蜡卷完整不破碎，放入1.5ml EP管中，常温运输。如有条件，建议备份10μm厚度切片2-3卷，进行RNA质检。某些组织类型由于同等体积下细胞数量较少，可能需要提供更多蜡卷，例如肺癌、心肌等。
FFPE样本核酸质检
FFPE 样本可以保存长达数年的时间，一般建议保存1-2年的蜡块做下游单细胞实验。样本在实验前需要做总RNA提取，进行核酸质量检测，核酸质检主要用到核酸片段分析仪，常用的仪器主要有安捷伦2100和BIOptic Qseq 100等。
使用FFPE样本进行单细胞测序时，DV200>40%的样本可以获得比较好的检测结果（DV200指长度大于200nt的RNA片段占总的RNA片段的比例）。
FFPE样本解离
通过FFPE样本制备单细胞核悬液的具体方法，可以参见“单细胞测序样本解离攻略——常见组织石蜡包埋样本”，回顾一下其中的基本步骤。还有一些细节问题这里进行补充回答，以飨读者。
样本解离准备完毕后，即可开始FFPE单细胞测序实验。尽管FFPE处理对生命科学研究来说是革命性的，但这种处理方式会破坏RNA分子，让转录组学水平的研究复杂化，因此成为阻碍科研及临床研究者进一步探索这类样本中蕴含的宝贵信息的主要因素。而传统的单细胞技术受限于poly(A)捕获的实验原理，难以完成FFPE样本单细胞检测。
2022年，M20 Genomics推出的全样本高通量单细胞测序产品VITA系列，通过独特的随机引物设计以及化学反应流程，可对转录本的所有片段进行捕获，即使在FFPE样本中也体现出了较高的灵敏度。
该系列产品在实验中表现如何？其数据是否可以满足科研人员检测FFPE样本的需求？作为面向市场应用多时的产品，VITA系列已完成了多个肿瘤FFPE样本的单细胞转录组检测（表1&表2），除常见的人类肝癌、人类肺癌、人类心脏等样本外，还包含了鼻咽癌、肉瘤等小癌种。一起来看看实测数据表现如何：
01基础数据
利用M20 Genomics平台完成细胞核原位逆转录，在VITA Cruiser仪器上完成细胞捕获及标记，基于Illunima Novaseq 6000平台进行二代测序，表1中的FFPE样本实际检测细胞数均较多，且基因检出率较高。
值得一提的是，VITA产品在穿刺样本中也有惊喜表现（表2）。高通量单细胞测序技术对样本的要求极高，需要将样本制备成高质量的单细胞悬液才能进行后续实验。但穿刺样本的量非常少，获得合格单细胞悬液的难度非常大。穿刺样本在后续实验过程中，能获取到的细胞数也比较少，但这次实测数据用了20μm，切了3卷，在量不多的情况下，数据表现也非常不错。
02全长覆盖分析
M20全长转录组一大优势就是能够对RNA进行全长无偏倚捕获，以人类肝癌和乳腺癌FFPE样本为例展示5'-3'基因覆盖情况，测序数据均全长覆盖，且覆盖度均一，无明显偏好。
03lncRNA分析
长链非编码RNA（Long non-coding RNA, lncRNA）是指长度大于200个核苷酸的非编码 RNA。 研究表明，lncRNA 在表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用，是目前的研究热点之一。
基于独特的随机引物捕获原理以及相应的特殊生物化学反应流程，VITA平台可以对样本细胞中的lncRNA信息进行进一步的分析。
同样以人类肝癌和乳腺癌FFPE样本为例，选择前3000个高变异基因（mRNA+lncRNA)进行leiden算法聚类和UMAP算法降维分析，2个样本均有21个细胞亚群（图A）。同时，使用UMAP算法对前3000个高变异lncRNA进行降维，分析结果显示通过lncRNA也可以非常好地进行细胞的区分（图B）。以上结果表明通过VITA平台，很有可能在单细胞中寻找到具有重要生物学意义的lncRNA。
多个样本的实测结果证明了VITA系列产品在FFPE样本中的优异表现，充分说明了M20 Seq的可靠性，能够为科研人员提供更多单细胞技术选择。有感兴趣的科研人员可以通过M20官方授权的服务商联川生物进行科研合作。
关于联川
ABOUT LIANCHUAN
杭州联川生物致力于为全球各地的科研用户提供基因组、转录组、表观组、蛋白组、代谢组，以及单细胞和空间组学测序服务。
单细胞和空间转录组测序作为联川重点科研服务产品，目前已经搭建完成包括10x单细胞测序（ScRNA-seq、ScRNA-seq＆VDJ及ScATAC seq），10x空间转录组测序（Visium 、CytAssist），10x Xenium及华大时空组学（stomics）测序平台。联川生物实现从nm到um，从单细胞到亚细胞的全生态单细胞空间原位检测的布局。在样本制备和生物信息学分析，以及云分析平台方面充分发挥自身优势，联川生物致力于为客户提供优质的服务。
目前已经与多个国家及地区的100多个科研院校、医院、制药公司建立起了长期的合作伙伴关系，累计发表单细胞和空间转录组测序相关的SCI高质量论文已超过130篇，影响因子平均15+，其中空间转录组相关文章10余篇（包含单细胞&空间转录组联合分析文章）。联川在单细胞&空间组学整合分析具备成熟的流程和云分析工具，对于数据挖掘和生物学故事具备深度的理解力，是值得信赖的多组学整合专家！
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