单细胞+m6A联合分析揭示涡虫再生机制 | m6A专题
文献名：m6A促进涡虫再生
期刊名称：Cell Proliferation
发表时间：2023
影响因子：8.5
所用组学：scRNA-seq、RNA-seq、m6A-seq
再生是受损组织或器官的再生，这是对原始生物到高等哺乳动物损伤的重要过程。涡虫具有活跃的全身再生能力，因为其拥有大量的成体干细胞，即新生细胞，为描述再生的潜在机制提供了一个理想的模型。m6A甲基化修饰参与了许多生物过程，包括干细胞的自我更新和分化，特别是造血干细胞和轴突的再生。然而，m6A如何在整个生物体水平上控制再生仍在很大程度上是未知的。
在这里，作者证明了m6A甲基转移酶调节亚基w的消耗可能通过调节涡虫的再生和与细胞-细胞通信和细胞周期相关的基因。单细胞数据分析揭示，wtap敲除诱导了一种独特类型的神经祖细胞样细胞，以细胞-细胞通信配体grn的特异性表达为特征。有趣的是，m6A修饰的转录本grn、cdk9或cdk7的缺失部分挽救了由wtap敲除引起的涡虫再生缺陷。
总之，作者的研究揭示了m6A修饰在调节全生物再生中不可或缺的作用。
首先作者为了了解涡虫再生过程中的基因表达动态，作者在截肢后的五个不同的时间点进行了rna测序（(0 hpa、6 hpa、3 dpa、7 dpa、11 dpa；0 hpa为截肢后立即采集的样本；图1A），为了了解涡虫在不同时间段的各个基因的表达变化趋势，作者通过k-means聚类分析，这些基因根据表达模式，被分为5个clusters，每个簇包含的基因组在截肢后的某个时间点特异性上调（图1B）。并且作者观察到m6A调控因子，mettl3, mettl14，wtap，在截肢后的3、7和11小时显示表达上调（图1C），并且它们都属于cluster 3和cluster 4。
GO富集分析发现，簇4中的几个基因与系统过程、信号传导和细胞通信的调控有关(图1D），包括生长因子和转录因子，如wnt2和egfr（图1D）。GO富集分析显示，簇4中的基因也参与了神经系统的发育和分化（图1E）。由于m6A调控因子与cluster 4中的基因具有相似的表达趋势，这些发现表明m6A在涡虫再生的调控中发挥重要作用。
图1
为了探究m6A甲基化修饰在涡虫再生中的作用，作者首先通过质谱检测，发现相较于rna修饰，m6A修饰水平很高（图2A）然后作者对之前的截肢后的6个时间段的样本进行m6A测序（图1A），并通过数据分析，结果表明在5个不同的再生时间点上鉴定出9057-13362m6a peak，作者发现m6A峰在终止密码子附近明显富集。此外，m6A在不同再生时间点之间的分布规律相似（图2B）。
通过GO富集分析发现，含有m6A修饰的gene与信号转导、细胞分化和神经系统发育相关（图2D），表明m6A在这些再生相关过程中发挥了重要作用。同时，GO分析表明，在再生期间，其含有m6A甲基化修饰的基因与对刺激、细胞通信和信号转导通路的反应有关（图2E)。
通过根据再生过程中m6A修饰水平变化的不同模式对基因进行分类，作者发现，在再生过程中，m6A水平变化与wtap表达变化趋势相同的基因与细胞通信、信号转导和系统发育有关，相反，在再生过程中m6A水平降低的基因参与了mRNA稳定性和细胞周期G2/M相变相关通路的调控(图2F-G )。这些结果可能暗示了m6A在细胞间通信和神经元发育中的潜在作用。
图 2
为了进一步研究m6A修饰在涡虫中的调控机制，作者首先对m6A甲基转移酶调控亚基wtap进行了原位杂交，发现wtap与新母细胞标志物smedwi-1特异性共定位，特别是在后部区域，表明m6A在新生细胞中起调节作用（图3A，B）。为了研究m6A修饰是否对涡虫再生不可少，用RNAi敲除关键调控单元wtap，然后在蠕虫的前后区域都被切除（图3C)。与对照组相比，wtap的蛋白表达和mRNA水平显著降低（图3D）。且在7 dpa时，mRNA m6A水平降低了近80%。
与对照组相比，缺乏wtap的涡虫未能完全再生被切除的组织部分，对照组在9 dpa时再生头部和尾部组织（图3E)。此外，在3 dpa时，缺乏wdap的涡虫区新再生的组织明显小于对照组的涡虫。与对照组涡虫相比，wtap缺陷的涡虫伤口区域形成的芽基也更小，缺失的前后组织无法生长(图3F )。特别是在7 dpa时，当对照组的涡虫重新生长出光感受器时，wtap敲除的涡虫似乎仍然不能从它们愈合的伤口中产生任何新的组织。
作者注意到，在wtap敲除的涡虫中，smedwi-1 RNA的表达没有明显的变化（图3G）。由于smedwi-1 RNA是涡虫干细胞的典型标记物之一，wtap介导的m6A消耗可能会影响新生细胞的功能。同时，再生水平的特征以神经系统的再生为特征，包括一对腹侧神经索和大脑。
然而，通过pc2的荧光原位杂交（FISH）染色显示，在wtap敲除的涡虫中，这两个部分都没有重新生长（图3g、H），一种在整个涡虫中枢神经系统（CNS）中表达的神经肽处理器。免疫荧光显示，除了不能再生新组织外，现有组织在wtap敲除后也出现异常，如排泄系统中缺失的原肾的纤毛“火焰细胞”（图3I)和无序的肌纤维（图3J）。
新母细胞和祖细胞增殖异常或终末分化细胞凋亡可能导致再生受损和组织形态异常，因此，作者研究了wtap敲除的涡虫的增殖和凋亡是否受损。作者首先进行了BrdU脉冲追踪标记实验，发现在wtap敲除中，BrdU标记的细胞涡虫比在对照组涡虫在截肢部位附近更富集，表明与对照组相比，wtap敲除后的截肢部位附近的细胞增殖更明显。TUNEL法检测结果与BrdU脉冲追踪标记实验结果一致。
这些结果表明，m6A对涡虫再生至关重要，其缺失会导致细胞异常增殖并伴随细胞凋亡增加。
图 3
为了研究wtap敲除后m6A水平降低介导的涡虫再生缺陷的潜在分子机制，作者在对照组和wtap缺失后的涡虫中进行了MeRIP-seq（图1A)。尽管与对照组相比，wtap敲除时m6A在CDS上的分布仅略有不同，在再生过程中，在每个时间点，wtap敲除时，终止密码子附近的m6A峰值明显减少（图4A）。
作者发现，在簇4中有上调趋势的基因中（图1B），许多基因在wtap敲除后表现出紊乱的表达模式（图4B）。此外，GO富集功能分析表明，这些基因与信号传导、细胞通信的调控有关 异常和信号转导相关通路（图4B）。
然后，作者分析了对照组和wtap敲除涡虫之间每个时间点的差异表达基因。在再生过程中，数量的上调和下调 d基因从0 hpa开始上升，在后期发生变化的基因数量最多，这表明，wtap缺陷通过影响再生的多个阶段的一系列基因，最终导致再生失败。这表明在再生过程中，wtap缺陷具有持续、持续和特定的作用。基因集合富集分析显示，与对照组相比，wtap缺陷样本的细胞周期检查点特征显著上调，而细胞-细胞信号通路显著下调 定位（图4C)。
然后，作者使用磷酸化的组蛋白3（H3p）进行了免疫荧光分析，这是M期的典型标记，在wtap敲除后M期细胞百分比显著增加，对照涡虫5 dpa后无显著差异（图4D、E）。G2/M期的关键调控因子之一，Cyclin B1在再生过程中显示出FISH染色水平的升高。因此，结合在伤口部位附近未改变的增殖，但在wtap敲除后增加了细胞凋亡的结果。
作者认为，wtap缺失可能导致细胞进入细胞周期，导致M期停滞，最终导致细胞死亡。作者进一步观察到周期独立激酶7（cdk7）和cdk9的mRNA表达，两者都是重要的细胞周期相关因子，在wtap敲除后表达上调，而m6A修饰水平下降（图4F），在wtap敲除后，与细胞-细胞通信相关的基因，如notum和kcnd2，被下调，其m6A水平也下降。
此外，用wtap双敲除cdk7或cdk部分挽救了wtap敲除组中9%的再生蠕虫的wtap敲除表型（图4G），从9%的再生蠕虫中，cdk7/wtap和cdk9/wtap双敲除组分别为39%和37%（图4H），而cdk7和cdk9的单一敲除均不影响再生。这表明wtap敲除表型是由cdk7或cdk9介导的。综上所述，WTAP可能通过m6a修饰的基因在细胞间通信和细胞周期中发挥作用来控制涡虫的再生。
图 4A
为了进一步的揭示m6A甲基化修饰对涡虫再生的调控机制，作者从对照和wtap敲除样本的5个时间点（0 hpa、6 hpa、3 dpa、7 dpa、11 dpa）对地中海裂腹涡虫进行了单细胞转录组测序。从所有样本的所有测序数据集中，共成功检测到86,758个细胞。这些细胞被聚集在一起，生成一个完整的细胞类型特异性图谱。
为了识别单个细胞类型，作者首先使用高度可变的基因进行了无监督聚类，并通过统一流形近似和投影（UMAP）方法获得了116个聚类。然后，作者通过识别标记基因来阐明每个聚类的细胞类型身份，并将其与之前的研究中的标记基因进行了比较。总的来说，在对照组和wtap敲除样本中都发现了7种细胞类型组，如新生细胞、神经元细胞、肌肉细胞、肠道细胞、分泌细胞、表皮细胞和实质细胞（图5A）。
为了探索m6A在涡虫再生过程中细胞谱系形成中的调控作用，作者比较了对照和wtap敲除涡虫的细胞-细胞组成。作者发现在再生过程中发生了变化。在截肢后的七小时，对照涡虫再生神经细胞比例约为25.03%，wtap敲除涡虫再生神经细胞比例为18.65%，而对照涡虫比例约为25.50% (6.38%/25.03 %)在wtap敲除后，神经元细胞比例下降。
值得注意的是，在wtap敲除涡虫后，大约有四分之一的神经元细胞不能正常地重新繁殖（图5B）。除神经元细胞外，其他类型的细胞在对照组和wtap敲除样本之间的分布相似。为了探索wtap敲除后的细胞功能变化，作者比较了每种细胞类型的对照和wtap缺陷样本，发现表皮和新生细胞包含最多的差异表达基因（DEGs）。
GO富集分析显示，在再生过程中，在wtap敲除后，表皮中上调的基因在核酸代谢过程和细胞周期相关功能中富集，并与新生细胞的细胞周期调控功能有关。下调的基因分布于表皮细胞、新生细胞和神经元细胞中，分布时间为3~11dpa。
此外，表皮细胞中下调的基因与组织极性的建立、翻译和ATP生物合成过程的建立有关。新细胞中下调基因的功能与RNA剪接、DNA复制起始、蛋白质折叠等有关。神经元细胞与蛋白质折叠、神经递质分泌和突触功能的信号释放有关。
这些数据表明，wtap敲低诱导的再生迟缓可能是通过影响新胚细胞和神经元细胞的细胞周期和信号转导途径。
图 5
单细胞数据结果显示，wtap敲除后，神经系统的比例发生了显著变化，而与已知的m6A甲基转移酶表达趋势相同的m6A修饰基因在神经元细胞中富集（图5C、D）。此外，在wtap敲除后，涡虫不能再生神经索结构（图3G，H）。为了探讨涡虫神经系统异常再生的潜在机制，作者根据报道的标记物进一步对神经元细胞进行分类，并通过Seurat将报道的聚类标签转移到作者的数据中。
作者将神经元细胞聚为9种亚型，神经祖细胞，NP样细胞、ChAT神经元1、ChAT神经元2、 GABA neurons, otf + cells 1, otf + cells 2, npp-18+ neurons, cav-1+ neurons（图5E)。其中，作者在wtap敲除后的再生过程中发现了一个独特的np样细胞簇（图5E，F），与神经前体细胞相似，在再生过程中逐渐增加，但在对照组涡虫中很少检测到（图5G）。作者进一步鉴定出grn（SMED30003962）、ubiqp（SMED30009873）和dph1（SMED30026267）是np样细胞的m6a修饰的特异性标记物（图5H）。
为了进一步研究nk-like细胞在涡虫再生中的作用，作者分析了wtap敲低对np样细胞标记物表达的影响。首先，IGV和富集分析显示，在IGV下调7和11 dpa后，grn和ubiqp转录本上的m6A修饰水平显著降低（图6A)。同样，WTAP介导的m6A缺失导致了wtap缺失的涡虫中grn和ubiqp表达的急剧增加。此外，通过两个荧光原位杂交和免疫荧光分析，作者观察到grn mRNA和蛋白水平的增加（图6B-D），以及np样细胞的两种标记物grn和dph1的共定位增加（图6B，C）。此外，通过对wtap和grn的双基因敲除，已经恢复了dph1的表达。
据报道，GRN是一种对神经元功能很重要的分泌蛋白48-50 并且可以在一段距离内发挥作用。此外，GRN可通过直接促进G1期至M期来刺激细胞分裂。作者发现，与对照组相比，wtap和grn的双敲除显著挽救了wtap敲除导致的涡虫再生失败（图6B-F），尽管grn基因敲除并不影响再生。此外，通过FISH染色显示，在grn、cdk7或cdk9双敲除后，np样细胞簇消失（图6B-D）。此外，BrdU和H3p共染色显示，与grn、cdk7或cdk9双敲除的蠕虫的细胞增殖模式和细胞周期状态恢复。值得注意的是，pc2的整个mount FISH染色也显示双敲除蠕虫的中枢神经系统再生恢复（图6G，H）。
作者的单细胞测序数据显示，Cyclin T1（ccnt1）、cdk7和cdk9在新细胞中的转录丰度相对于wtap敲除涡虫中的任何其他细胞，，基于使用CellphoneDB的细胞-细胞通信分析，np样细胞可能通过grn靶向其受体类型1与其他细胞类型的细胞进行通信。这些结果表明，由np样细胞排出的GRN可能会作用于新生细胞。同时，对于其他含有m6A修饰的细胞-细胞通信相关基因转录本，如mtnr1b，它们的配体也被m6A修饰，并在wtap敲除时上调，似乎参与了涡虫的再生。这些数据表明，WTAP介导的m6A控制着GRN的表达水平，从而进一步影响了涡虫的再生。
图 6
此研究揭示了WTAP介导的m6A修饰在整个生物体再生中的重要作用。作者进一步发现，WTAP介导的m6A修饰对于神经前体细胞群尤为重要。该研究可能揭示了一种新的调节涡虫再生的新机制，利用GRN来监测并允许再生正确发生，因此，研究结果强调了细胞-细胞通信在涡虫再生过程中的潜在重要性，并为未来的再生医学研究提供了重要的见解。
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