10x Xenium平台最新应用：单细胞原位测序揭示多发性硬化症病变的空间动态【文末开启预售优惠通道】
瑞典卡罗林斯卡学院的G. Castelo-Branco和斯德哥尔摩大学的M. Nilsson共同合作，在BioRxiv上发布了预印本稿件“Single cell-resolution in situ sequencing elucidates spatial dynamics of multiple sclerosis lesion and disease evolution”，联合使用原位测序（In situ Sequencing ，ISS）技术和Xenium原位杂交平台在单细胞分辨率下揭示了多发性硬化症（Multiple sclerosis，MS）病变的空间动态。Xenium是一个由10x Genomics提供的空间组学平台，帮助用户实现亚细胞分辨率的靶向基因和蛋白表达原位分析。
Xenium分析仪将单分子RNA和蛋白检测的功能与强大的光学元件、数据采集和解码技术相结合，能够以亚细胞分辨率在整张切片上快速检测大量靶点的组织原位表达水平。Xenium平台可帮助科学家展示、定量和分析固定在Xenium载玻片上的组织切片中的基因表达和蛋白丰度。该平台可以兼容多种样品类型，包括新鲜冷冻（FF）组织和福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织。
MS是一种复杂的炎症性和神经退行性脱髓鞘疾病，影响中枢神经系统 (Central nervous system，CNS) 的各个解剖区域，如大脑，脊髓的白质 (White matter，WM) 和灰质 (Grey matter，GM)，病变区域表现为炎症、神经胶质增生、脱髓鞘和/或神经变性特征。MS患者的病变类型具有异质性，可依组织学方法分为活动性、混合活动性以及非活动性三类病变，了解病变的细胞和分子特征有助于完善病变分层。此外，了解MS病变的炎症和神经病理学的时空特征有助于了解MS的病程发展。
在该项研究中，作者首先使用ISS研究了不同疾病阶段，不同解剖区域的实验性自身免疫脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）小鼠模型的单细胞空间表达谱特征，以此模拟MS的细胞时空动力学。之后，作者将ISS和Xenium原位杂交平台应用于两个人类MS颈部脊髓切片，研究其空间细胞谱并通过解卷积方法识别了组织学方法无法识别的新的病变区域。
该项研究发现了1.小鼠MS的活动病变具有离心式发展的特征。2.疾病相关的神经胶质细胞在病变之前形成，并独立于病变发展。3.人类MS的疾病相关的神经胶质细胞分布具有差异性，ISS和Xenium原位杂交平台可以识别新的病变区域。4.建立了小鼠和人类MS的病理学空间数据，揭示了MS进展背后的复杂细胞动力学。
作者建立了对照组（Ctrl），EAE高峰期（peak EAE）和EAE晚期（PSO）模型分别模拟MS的病变前期、急性期和晚期阶段，以了解MS不同疾病阶段的病变特征并建立病变发展时序。除PSO只选取腰部脊髓（lumbar spinal cord，L）切片外，作者对Ctrl和peak EAE选取4个CNS解剖区域进行比较，分别是脑部（coronal brain，B），颈部脊髓（cervical spinal cord，C），胸部脊髓（thoracic spinal cord，T）和腰部脊髓（lumbar spinal cord，L），以研究MS不同解剖区域的病变特征和病变空间进展顺序。【Fig 1A】
以神经胶质细胞，神经细胞，免疫和血管相关细胞为主要研究对象，通过对公共单细胞转录组数据集进行特征提取，得到239个分子特征应用于ISS的建库和测序，对ISS数据进行聚类和细胞注释后得到包括稳态CNS驻留细胞、疾病相关（disease-associated，DA）CNS驻留细胞和免疫细胞在内的共计3大类，23种，41亚群细胞。其中，神经胶质细胞（glia）有：少突胶质细胞（OLG，OCP/COP，MOL），星形胶质细胞（Astro），小胶质细胞（MiGL）和施万细胞（Schw），免疫细胞有：CNS相关巨噬细胞（CAM），树突状细胞（DC），单核细胞/单核细胞衍生细胞（MC/d）和T细胞（T）。peak EAE呈明显炎症细胞浸润并有着特异的疾病相关的神经胶质细胞（Disease-associated glia，DA-glia）。【Fig 1B,C】
对解剖区域内、解剖区域间和不同疾病阶段细胞组成、分布情况以及分子表达特征进行比较和描述后，【Fig1 C,D】关注免疫浸润特点发现：1. peak EAE脊髓内的免疫浸润从脊髓尾部到头部逐渐减轻，但大脑中存在明显的免疫浸润，可见MS的病变起始具有空间偏好性。【Fig1 E,F】2. Peak EAE脊髓不同解剖区域内免疫浸润不同，晚期MS的炎症普遍减轻，但某些特定区域炎症消退缓慢，可见脊髓解剖区域和脊髓束内的炎症动力学不同。【Fig1 E】
基于23种细胞类型对Ctrl进行细胞邻域分析，聚类注释得到大脑的6个生理区室和脊髓的4个生理区室，此外，对peak EAE进行分析还得到1个疾病相关的大脑病理区室（大脑炎症浸润区bIIC），3个疾病相关的脊髓病理区室（病变核心区LCC，病变边缘区LRC，病变周围区PLC），对PSO进行分析得到1个疾病相关的脊髓病理区（晚期病变区LLC）。【Fig2 A-C】以大脑中央管道CC和脊髓白质WM和灰质GM作为对照，对解剖区域内、解剖区域间和不同疾病阶段的疾病相关病理区室内细胞组成和丰度进行比较和描述，【Fig2 D-H】发现1. bIIC区具有较多的疾病相关神经胶质细胞和血管细胞。2. LCC是复杂病变的中心区域，具有最高丰度的MC/d细胞和DC。3.LRC常在LCC周围，含有较高比例的DA-MiGL、DA-MOL2和DA-Astro。4.PLC是复杂病变的外围区域，含高比例的DA-glia。5. peak EAE脊髓内病变区室复杂度从尾部到头部逐渐减轻，结合先前免疫浸润从尾部到头部逐渐减轻结果，可知随着炎症的发展，病变核心的转变方向为：PLC→LRC→LCC，呈现离心式进展。【Fig3 B,C】对15个区室进行轨迹推断也验证了这一进展趋势。【Fig3 D】6. PSO的病变区LLC位于浅表MW和腹侧区域，呈明显的神经胶质增生和血管群增加，证明晚期病变区室的炎症减轻，正在形成纤维化瘢痕。【Fig2 D,E; Fig3 B,C】
接下来，作者对peak EAE的DA-gila的转录组特征及其空间分布进行了深入探索，发现：1.所有DA-glia均表达参与干扰素反应和抗原呈递的基因.【Fig 4C】2. 脊髓内的DA-glia相对丰度从尾部到头部基本保持不变，而先前发现peak EAE脊髓内的免疫浸润度和病变区室复杂程度从尾部到头部逐渐减小。【Fig 4D】DA-glia在PLC内富集，而先前发现免疫炎症向着PLC→LRC→LCC离心式进展。【Fig 4E】因此，神经胶质细胞的病变与病变负荷相独立。（注：病变负荷是指在脑和脊髓中出现的神经髓鞘损伤和炎症性病变的总量和分布。）此外，在Ctrl脑的WM中出现了少量的DA-glia，表明DA-glia在炎症病变之前就已存在。【Fig 4A】
然后，作者比较了peak EAE和PSO的数据，以研究不同疾病阶段DA-glia的数量和分布特征，发现：1.晚期DA-少突胶质细胞大幅减少，DA-星形胶质细胞半数减少，小胶质细胞大多仍处于DA状态，因此神经炎症对大部分的小胶质细胞和部分星形胶质细胞具有长期的影响，而少突胶质细胞可以重建平衡。【Fig 4A,D】2.晚期的DA-glia由peak EAE的广泛分布转变到主要分布在WM和病变区室，可见DA-glia（特别是DA-MiGL，DA-Astros和DA-OPCs）可能发生了重定位。【Fig 4A】3.许多稳态glia在急性期消失，在晚期重新出现并靠近LLC，表明晚期病变内的稳态glia可能是新生成的。4.Serpina3n在Peak EAE的实质、PLC区室高度富集，在PSO的LLC区室中上调。并且使用Serpina3n治疗EAE起到了神经保护和维持髓磷脂完整性的作用，推测Serpina3n的表达可能有利于神经胶质细胞的生存。【Fig 4D,F】
根据细胞的接近程度探索细胞之间的相互作用，发现在EAE不同疾病阶段和不同解剖部位，DA-glia始终是各种细胞相互作用的中心。【Fig 5】结合scRNA-seq数据推断在DA-glia形成和功能维持中起作用的配受体对，发现DA-小胶质细胞和 DA-星形胶质细胞可能通过 Prosaposin 和 TNF 信号传导等调节少突胶细胞的状态，DA-小胶质细胞也受到DA-少突质胶质细胞细胞相互作用因子的调节。【Fig 5D】
最后，作者分别使用Xenium 原位杂交平台技术和ISS技术对活动性病变和非活动性病变的人类MS颈部脊髓切片展开空间表达谱研究。根据Xenium数据的MOG和HLA-DMB的表达与组织染色结果进行病变区域的共定位，发现了一个未被组织学实验发现的非活动性病变区。【Fig 6B】ISS数据分析鉴定了38个细胞亚群，研究解剖区域内不同细胞亚群的分布可见星形胶质细胞和少突胶质细胞亚群MOL_Opalin偏好分布在GM中，而少突胶质细胞亚群MOL_Klk偏好分布在WM中，推测GM和WM的特异环境可以诱导不同的少突胶质细胞状态或这些区域需要特定少突胶质细胞的支持。
为了识别正常外观实质内的解剖和病变区室的病理变化，使用24类主要的注释细胞进行区室分析。两个样本共注释到了4个已知解剖结构的区室，5个血管区室9个病变区室。新发现的非活动病变区与对侧已知的非活动病变区具有相同的区室组成，凸显了ISS具有识别组织学发现不了的病理变化的能力。【Fig 7A,B】推断不同区室的轨迹发现WM出现了三条主要病变轨迹，这些轨迹具有区域偏好性。【Fig 7F】研究人类样本中稳态大胶质细胞和DA-大胶质细胞的丰度和分布，发现DA-少突胶质细胞和DA-星形胶质细胞在活动性病变样本分布广泛，而DA-星形胶质细胞在非活动性病变样本中只分布在WM。结果表明小鼠EAE和人类MS样本中某些神经胶质细胞的状态和分布是类似的。【Fig 7C,E】
该研究使用 ISS 在空间单细胞分辨率下研究动物模型和人类MS的神经病理学特征，为MS疾病演变的动态提供了新的见解，例如将整体神经病理学与病变演变分开。通过揭示MS病理发展过程中不同细胞群之间的相互作用，更好地了解了CNS疾病进化的细胞机制，为治疗MS提供新的细胞和分子途径治疗靶点。该文章应用10x Xenium平台仅用266个人脑基因的表达panel就在两个样本中鉴定了240,372个细胞，并发现了组织学不能发现的非活动性病变区域。同时该文献也为我们提供了一个很好的范例，告诉我们原位技术平台如何与生物学问题相结合，为我们提供更大的技术挖掘空间。
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