【精华回顾】刘天罡教授分享天然产物智能制造与创新发现

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导言：5月28日，中国医师协会临床精准医疗专业委员会和转化医学网举办了精准医学新发展系列在线直播研讨会第二场，共有四位专家在线分享了合成生物学细胞智造。本次直播中途，第一位专家刘天罡教授见评论区仍有不少问题，还特地返场进行了答疑，现场气氛火热，直播在线研讨会十分成功！以下是小编对刘教授的授课内容进行的重点内容整理。

刘天罡 教授 

武汉大学药学院教授 

专注在代谢工程和合成生物学方向，致力于天然产物合成机制的解析以及在此基础上的微生物药物和化学品营养品的创新和高效制造，相关研究成果获得2018年湖北十大科技事件及2019年湖北省科学技术进步奖一等奖。发表《PNAS》、《JACS》、《Metabolic Engineering》、《Angew Chem》等50多篇SCI论文，总SCI引用次数超过1600次，H指数24；担任杂志《ACS Synthetic Biology》编委，《Metabolic Engineering Communications》副主编，并十多次受邀在国际会议上做报告。

刘教授为大家分享了回国十年以来与天然产物相关的工作。

首先，他提及了最近大家比较关注的新冠病毒感染的情况。目前感染人数还是在逐渐上升，但中国的控制情况比较好。由于他们在武汉大学，所以正处于暴风雨中心。今年一月份，他们实验室第一次得知病毒序列时，就开发了纳米孔测序方法（Nanopore Sequencing）来精准地判断新冠病毒，同时能检测十大类的呼吸道病毒。一月底，他们进入武汉大学附属人民医院，对当时的临床上不能判断的或核酸试剂盒是假阴性的病例进行了判断，大约做了300多例。而且他们成功后很快获得了《人民日报》、《科技日报》、《焦点访谈》，以及国务院联防联动的新发布会进行的四十分多钟专题介绍。

刘教授本次报告中大主题是精准医学。他表示，在精准医学方面，大家以前经常关注的是肿瘤，而感染领域会是未来发力的一个非常重要的领域。

Nanopore Targeted Sequencing纳米孔测序方法：SARS-Cov-2快速鉴定和分型

这是刘教授等开发的一个多靶点的精准的通过先PCR然后测序的方式去获得病毒的序列。运作同时也能对病毒进行分析，以及对其突变进行监控。

2050年细菌耐药性平均致死量-预测

目前除了新冠病毒病比较流行，其实还有一个潜在的危险因素，那就是细菌的耐药方面。预测在2050年，细菌耐药方面的死亡可能会是人类的死亡的第一主因，可能每年大约得有超过一千万人死于此感染。

Nanopore Targeted Sequencing当天鉴定细菌真菌感染

NT3与培养金标准比较，具有更高的阳性检出率

从样本接受开始，24h内可同时鉴定细菌和真菌感染，最快6h鉴定感染菌

刘教授的平台同时也针对细菌和真菌感染对人不同病种的来源，进行精准测序的判断。可在当天给一个预报告，第二天给一个正式报告，这个速度已经是非常快了。临床上面也做了大几千例的这种实验，确实发现了能够真正的帮助病人和医生更快速地锁定病原体，然后精准地使用一些抗生素进行治疗。

天然产物

回归主题，刘教授研究的课题就是跟天然产物相关的。天然产物有很大一类家族的抗生素，它们能很快发现病原体，就可以从“武器库”（工具）里选择最合适的武器去对抗。

在精准医学领域里，其实面临的难题不是没有武器，而是诊断的快慢问题。当很迅速选择一个合适的东西时，即使它是一个耐药细菌，但也不是所有微生物都对所有类型的抗生素耐药。所以，快速的诊断是非常重要的。

合成生物学与天然产物的智能制造——青蒿素

天然产物还和合成生物学的发展有一定联系。合成生物学在本世纪初，进入到天然产物的智能制造。最有名的一个帮助合成生物学引起世界关注的案例，是我国发现的青蒿素案例。青蒿素是抗感染抗疟疾药物。全球每年大约仍有两亿人感染疟疾，其中婴儿死亡率尤其高。

原先是通过植物种植，即种植黄花蒿，然后从黄花蒿里面提取里面的有效成分。这个过程对环境并不是很友好，而且，供应也很不平均。比如今年种的多，药物就很便宜；明年种的少，药物价格就很贵。对于使用的区域来讲，都不是特别富余。

美国的科学家通过利用微生物作为一个平台，在酵母里把来自不同物种的基因再进行重构。这就产生了青高嵩的前体，赋予了酵母一个新功能。酵母就是用做啤酒的酵母，它本来是什么都不产，但现在可以产生25g/L的青蒿酸，然后再通过化学半合成找到青蒿素。这样就改变了原有方式，大幅度地降低了成本。

合成生物学

合成生物学：以生物体系为平台，进行有目的的改造并赋予生命体新的功能的过程。

合成生物学就可以用一些计算机的语言、计算机或电子工程的思维，把DNA做成元件，把这些基因做成回路，再对生命体进行精准的控制，然后通过设计构建测试分析学习这样一个反复循环的过程来实现目的。

天然产物进入合成生物学阶段的关键科学问题

刘教授利用自己的科学成果，解释了以下三个问题：

·如何创造新的路径

·如何提高异源合成体系的效果？

·如何更快更多获得新产物？

·如何创造新的路径

刘教授以萜类化合物作为例子进行说明。

萜类的生物合成

萜类化合物是地球上最丰富的一类天然产物合成途径和合成类别，大约有7-8万多种天然产物是这类。它们的骨架都是5碳的单位，然后经过不同的缩合形成不同链长的碳10-40的骨架，然后再通过后面的修饰得到千变万化的一个中间体。这里面有著名的青蒿素、紫杉醇、人参皂苷和番茄红素，都是萜类的家族。

·如何提高异源合成体系的效率？

 利用合成生物学合成天然产物的普遍问题

合成生物学的一个难点：如何把从各个来源的生物里的酶放到一个大“餐馆”或一个酿酒酵母里。其实它们彼此之间是不能识别彼此的，使得它们之间的工作状态不是太好。而天然酶的状态是一个很好的复合体，它们很高效地被运作在一起。

天然多酶复合体

高效的催化能力

人工蛋白骨架

合成生物学领域发展得很好的一个方向，就是利用人工蛋白骨架的方式，对酶进行一个最精准的组装。

然后刘教授等选择了一个叫RIAD-RIDD的系统。这个系统是借鉴于人的哺乳动物cAMP信号通路里面的识别。

RIAD-RIDD人工蛋白骨架

D/D二聚物可结合AKAP的AKB结构域

它有一个像插销一样的系统，一个蛋白可以插到另外两个蛋白的中间，形成一个很紧密的结构。这样把两个蛋白作为一个标签挂在目的蛋白的n端，就可以人为地把这两个蛋白拉在一起，而且可以形成一个1:2的组装。

人工多酶复合体——MenH₂-MenD

甲基萘醌的生物合成途径

香港中文大学的夏江教授，作为合作者，在体外证实了刘教授这种方式可以组装成各式各样的系统。刘教授等证明了在体外把这些酶按照有序地组装起来，比分离的酶的反应效率更好。

利用RIAD-RIDD组装策略装配代谢节点引导目标代谢流

刘教授等把以上的概念介入到体内，选择体内比较重要的一些原件，把它们整合到一起，能够在细胞里改变代谢流。

RIAD-RIDD组装上下游模块的装配

之后，他们又选了一个虾青素的平台。这个平台里，最重要的节点相当于上游的代谢途径最后一个酶跟下游的代谢途径第一个酶连在一起。而且，Idi酶是在细胞室里，而CrtE酶是在细胞膜上。他们想把这两个代谢途径连接到细胞膜上。

Idi与CrtE实现体内装配

他们发现，通过这种方式的固定，原来的对照组的Idi通过电镜的染色，在细胞质里面大量表达。在固定化以后，大量的蛋白已经集中到细胞膜上了。

他们用其他的荧光方式制取表征，也证明了这两种蛋白确实是发生了这种现象。

模块组装实现大肠杆菌类胡萝卜素的高效合成

然后，他们把这个过程引入到大肠杆菌之前做虾青素的一个高产菌株里。这当时已经是很高产的一个方式，他们把它们连接在一起以后发现，能进一步以5.7倍提高了总的类胡萝卜素的产量。

酿酒酵母中RIAD-RIDD的组装

他们又把这个过程引入到一个产酿酒酵母番茄红素的系统里，也是把同样的Idi和crtE基因在其中进行了固定，番茄红素高产菌株产量提高了近60%，达到2.3g/L。

酿酒酵母番茄红素的工业化生产

这些工作整合在一起就可以实现用酿酒酵母做番茄红素的高产。番茄红素的生物制造将极大降低成本，成为一种新的生产方式。

·如何更快更多地获得新的产物？

天然产物的来源及研究现状

天然产物发展的过程：上世纪40年代，从青霉素的诞生开始进入高潮。上世纪六七十年代，大量的天然产物被发现。目前用的临床天然产物抗生素几乎都是在那个时候做出来的，只不过现在对这个产物的骨架进行了各式各样的修饰。但随着时间的延续，发现新的产物的速率逐年在降低，几乎没有新的抗生素在临床上出现。上一代最后一个抗生素是康舒达托霉素，大约是30多年前发现的，20多年前就进入临床。现在已经没有新的武器诞生了。

天然产物基因挖掘的策略

那么大家都在怎么做呢？怎么都想找到一个新的武器库呢？

·遗传操作：转录调节因子激活，启动子替换

·外源激发子激活

·异源重构

但是各有各的问题：

·建立基因操作的难度：

可以较容易地对多少微生物进行基因改造？

·各种酶在异源系统表达的严峻挑战：

需要选择合适的异源宿主。

·无法预测的、非靶向的激活会混淆挖掘目标

·如何轻松地表征含量极低的那些化合物

刘教授就此简单介绍了他们采取的解决措施。

首先，搭建萜类挖掘的工程平台

他们做了四种底盘：

·细菌来源：大肠杆菌

·植物来源：酿酒酵母

·放线菌来源：红霉素

·丝状真菌来源：米曲霉

基于基因组信息和自动化平台的高通量挖掘

那么大致的思路是什么呢？刘教授等是基于基因组和自动化平台的一个高通量挖掘。现在基因测序是越来越便宜，而且网上也有一些免费的基因测序。测序以后，为了找到基因簇，会把其他信息也都放上去。那么就通过预测，找到基因簇，通过基因合成或者引物的方式把这些基因都克隆下来，之后就可以在体外把基因加上相应的启动子。接着在大肠杆菌里，把这些基因片段进行一个组装，后转到相应的系统里组装和放大。然后在系统用这24孔板对它进行固体发酵，最后再对发酵出来的产物进行简单结构分析和生物活性分析。

以生物活性为导向的基因簇高通量筛选

之后，进行一个简单的萃取，萃取后就会加到不同的检测平台。用抗病毒的和抗细菌的一些筛选模型进行筛选。这样就可以很迅速地找到感兴趣的化合物。

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