【精华回顾】王素霞教授分享电子显微镜在临床疾病诊断与研究中的应用

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导言：6月11日，中国医师协会临床精准医疗专业委员会和转化医学网举办了精准医学新发展系列在线直播研讨会第三场，共有三位专家在线分享了显微成像技术助力精准临床诊断与研究。以下是小编对第一位专家王素霞的授课内容进行的重点内容整理。

王素霞 教授

北京大学第一医院主任医师

电镜室和超微病理中心主任

专业方向：肾脏病理和超微病理；国际肾脏病理学会(RPS)委员；中华肾脏病杂志编委；中华病理学杂志、Nephrology, PlosOne杂志特邀审稿人；中国电子显微镜学会常务理事；2010，2012年2次赴美国哈佛大学医学院附属Brigham and Women’s Hospital访问学者；现任北京大学第一医院电镜室及超微病理中心主任。科研成果：主持和参与多项国家自然科学基金课题，在国内外重要学术杂志发表论文60余篇，其中SCI收录30余篇。参与“肾活检病理学”专著编写，“获得卫计委、教育部和中华医学科学奖等奖项6项。

王素霞教授给大家分享的是电子显微镜在临床疾病诊断中的应用，她从以下四个方面给大家做逐一的介绍:

内容简介

·生物电子显微镜简介

·电镜检查在临床疾病诊断中作用

·电镜超微结构研究在科研中应用

·送检电镜检查的程序与基本要求

01

电子显微镜技术简介

生物电子类型及特点

·透射电镜（transmission electron microscope, TEM）

收集穿透组织切片的电子束进行成像，观察细胞内部的超微结构

·扫描电镜（scanning electron microscope, SEM）

电子束在样品表面进行扫描后成像，观察组织和细胞表面的立体结构

·免疫电镜（Immuno-electron microscope, IEM）

在超微结构水平及进行特定抗原或蛋白的标记

透射电镜（TEM）

·收集穿透样本的电子，经电子透镜成像后，经过中间透镜放大，在荧光屏成像，黑白放大像

·细胞切面及内部的超微结构

扫描电镜（SEM）

·电子束照射样本后，收集产生的二次电子，经过电子透镜成像，得到样本表面的图像。

·组织和细胞表面的立体结构

免疫电镜（IEM）

在超微机构水平定位某些分子：Ag，受体

冷冻电镜（Cryo-EM）

电子断层扫描（Eletron Tomography）

近年来电镜领域发展最迅速的技术——结构生物学（structural biology）

蛋白质分子、病毒及细胞器（离子通道、膜受体）等结构域功能关系

超微结构研究与电子显微学的发展

·高分辨率冷冻电镜与3D成像

90’s后，病毒、大分子大那笔、细胞器的结构域功能的关系，结构生物学

·超微病理学与电镜标记技术

70-80’s电镜诊断中心（diagnosticeletron microscope）

·电子显微镜技术的建立

1932年德国Ruska，第一台透射电镜，获Nobel奖

02

电镜检查在临床疾病诊断中作用

电镜诊断学——超微病理

·超微病理（ultrastructural pathology）

通过电子显微镜观察阻止和细胞的超微结构及其病理变化，在亚细胞结构水平进行疾病的诊断和研究，属于病理学的亚科之一

·优势与不足：

-具有高分辨功能，能够观察光镜不能分辨的细微病理改变，包括细胞核及染色质、细胞膜、细胞连接、纤毛和微绒毛、细胞器、胞质内涵体、基底膜及其特殊沉积物等

-观察视野有限，有局限性

电镜诊断具有重要价值的疾病

·肾脏疾病

·神经肌肉疾病，神经系统肿瘤

·肿瘤：低分化肿瘤，神经内分泌癌，恶黑

·感染性疾病：病毒感染，SARS

·血液系统疾病：白血病、骨髓瘤

·肝脏疾病

·异常代谢性疾病：糖尿病、淀粉样变

·先天遗传性疾病：Fabry病、Alport综合征等

肾脏疾病的电镜诊断

·对肾小球疾病的诊断有重要价值

-肾小球是肾脏滤过功能的结构基础-滤过屏障

  足突及其裂孔隔膜

  肾小球毛细血管基底膜（GBM）

  带窗孔的内皮

·发病机制：免疫复合物介导的肾小球肾炎

-抗原抗体复合物（免疫复合物）-电子致密物

-继发性肾炎：SLE，冷球蛋白血症等

肾脏疾病的超微病理诊断要点

肾组织电镜观察的重点：

√有特征性诊断价值的超微结构特征

·GBM结构

·足细胞及其足突结构

·电子致密物的沉积

·特殊有形结构的形成

（电镜诊断报告内容必须要描述）

（归纳）电镜检查具有重要诊断价值的肾脏疾病

·原发性肾小球病

  微小病变肾病、FSGS、早期膜性肾病，DDD，MPGN分型、感染后急性肾炎、纤维样及免疫触须样肾小球病

·继发性肾炎：

  不典型膜性肾病（HBV,SLE）、血栓性微血管病、系膜结节状肾小球病、早期糖尿病肾病、早期淀粉样变、副蛋白血症相关肾病、病毒感染相关性肾损伤

·遗传性肾病：

  薄基底膜肾病、Alport综合征、Fabry病、Ⅲ型胶原肾小球病、甲髌综合征、脂蛋白肾病、Fibronectin肾小球病

电镜检查在肿瘤诊断中作用

·诊断依据：

-不同组织类型细胞的超微结构特点不同

-肿瘤细胞的超微结构，与尤其来源阻止细胞核具有相似性，又不完全相同，分化更差。

·总体特点：

-细胞核：核膜不规则性↑，常染色质丰富，核浆比↑

-细胞质：细胞器变少，分化差，游离核糖体丰富

-细胞连接：发育不良，减少，微绒毛稀少

-细胞内分泌颗粒：不成熟，减少或形态变异

不同类型肿瘤的超微结构特点

·上皮性肿瘤：细胞连接常见，桥粒或桥粒样连接

-鳞癌：张力丝-桥粒复合体

-腺癌：可见腺腔，微绒毛，连接复合体

·间叶性肿瘤：缺乏细胞连接和基板

-横纹肌：粗细肌丝及Z线

-Langerhan’s组织细胞增生症：birbike颗粒

·神经内分泌肿瘤：

-神经内分泌颗粒：有空晕的致密核心颗粒

·恶性黑色素肿瘤：不成熟的黑色素小体

腺癌

·诊断指标：

-腺腔：细胞间腺腔或胞质内的微腺腔 ，腔面有微绒毛

-微绒毛：长短不一，大多短钝

-连接：紧密连接或连接复合体

-分泌颗粒：粘液颗粒、浆液性、板层状颗粒

（归纳）电镜检查具有重要诊断价值的肿瘤类型

·小圆细胞性肿瘤：

神经内分泌癌、胚胎性、腺泡性横纹肌肉瘤、尤文氏肉瘤小细胞性淋巴癌，骨肉瘤等

·大细胞性肿瘤：

腺癌、鳞癌、恶性间皮瘤、恶性黑色素刘、朗格汉斯组织细胞增生症、颗粒细胞瘤、腺泡性软组织肉瘤

·神经系统肿瘤：

脑膜瘤、胶质瘤、神经胶质混合性肿瘤、原始神经外胚层肿瘤、神经母细胞瘤、垂体瘤

·血液系统：

白血病（髓系、单核、巨核系、淋巴系）、浆细胞瘤等

（总结）电镜检查在疾病诊断中的作用

·决定性诊断作用

超微病理特征是主要诊断依据，无电镜不能明确诊断；

·辅助诊断作用

超微病理特征提供重要参考依据，对其分型、分期或合并的疾病诊断有帮助；

·互补或证实作用

超微病理特征与光镜病理诊断，相互印证或互相补充，进一步证实光镜的诊断。

03

电镜超微结构研究在科研中应用

超微结构观察是形态学研究重要方法

·细胞生物学研究的基本手段

  细胞核：肿瘤细胞、细胞凋亡（apoptosis）

  细胞器：线粒体-能量代谢、缺血缺氧、溶酶体病；自噬（autophagy）

  细胞膜：包膜小凹（caveolae）、纤毛病（ciliopathy）

  基底膜：糖尿病、遗传病、肿瘤浸润

·病毒感染及其致病机制的研究：病毒包涵体、病毒与宿主的相互作用

电镜标记与高分辨电镜技术的应用

·免疫电镜技术（免疫胶体金标记技术）

-immuno-electron microscope/immuno-gold labeling

-利用胶体金颗粒标记抗体，对相应抗原进行超微结构的定位监测，结构与功能相结合（初级）

·电子断层成像与3D重构：亚细胞三维立体结构

-electron tomography and 3Dreconstruction

·冷冻电镜与结构生物学：最新的前沿研究领域

-cryo-eletron microscopy, structural biology

-蛋白质大分子或亚结构的功能与结构的高级研究

04

送检电镜检查的程序与基本要求

电镜检查的标本来源

活检组织：肾，神经肌肉，皮肤，胸膜等

手术标本：肿瘤动物实验标本

细胞：血液、体液、培养细胞

电镜标本的取材、固定与运输

·组织取材要求：

小：组织块大小为1-2mm³或细条状2×4mm（似牙签）、准（病变部位）、冷（0-4°C）、快（断血后及时固定）

·固定液：

2-3%戊二醛，游离细胞用1%戊二酸

1%饿酸，后固定（电镜室执行）

·保存和运输：

低温（0-4%）保存，冷藏室，切记不可冻存！

保温桶内放冰，运送至电镜室

及时送检或置于冰箱冷藏（0-4°C）过夜后送检

取材方法：游离细胞

·培养细胞及游离细胞：细胞量>10⁶

-胰酶消化或物理刮去

-细胞悬液800-1000r/min离心5分钟

-Hank’s液洗两次，重复离心，轻弃上清，留取管底的细胞团，沿管壁缓缓加入1%戊二醇固定。

·末梢血或骨髓穿刺液

-选取绿色抗凝管（肝素抗凝）

-取外周静脉血5ml，或骨髓液3ml,尽快送检

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