利用中药网络药理学研究是如何突破5分SCI杂志？

最近, 上海中医药大学张卫东教授课题组在Pharmacological Research上发表论文” Computational systems pharmacology reveals an antiplatelet and neuroprotective mechanism of Deng-Zhan-Xi-Xin injection in the treatment of ischemic stroke” (Pharmacological Research, Vol 147, 2019: 104365) , 用网络药理学方法揭示了灯盏细辛（DZXX）抗血小板聚集和神经保护的作用机制。

这项研究采用的核心算法是符号网络上的随机漫步重起算法，用这个算法模拟药物对靶标的激活或抑制在信号网络上的扩散效果。这个算法在社会网络分析中用于模拟人与人的友好或敌对关系对网络上信息传播的影响，所谓朋友的朋友是朋友，敌人的朋友是敌人，听到朋友的好消息会开心，听到敌人的坏消息也会开心。两个问题虽属于不同领域，却有相似的机制，具有异曲同工之处。

1. 研究路线

研究路线包括4部分: (A) 数据收集: 收集DZXX的活性化合物和对应靶标、缺血性中风相关的疾病基因和药物靶标、疾病状态和药物干预下的差异表达基因; (B) 数据分析: 识别重要靶标、靶标干预的信号通路、具有相似表达谱的药物、DZXX影响的子网络; (C) 实验验证: 验证重要靶标以及药物功效; (D) 结论: 从靶标、通路、效应和网络层面解析DZXX的作用机制。见Fig. 1. 

Figure 1 DZXX 治疗缺血性中风的网络药理学研究路线.

2. 血清中检测到的DZXX的化合物及预测的靶标

前期血清药物化学实验在用药后的血清中检测到 36 个化合物，其中包含26个原型化合物和10个代谢物。用STITCH, SwisstargetPredict, TCMSP预测到83个高可靠性的靶标。

3. 基因表达实验及差异表达基因

将DZXX以及它的三个活性化合物 apigenin (PubChem CID: 5280443), apigenin-7-o-glucuronide (PubChem CID: 5319484), quercetin-3-O-glucuronide (PubChem CID: 13258914), 分别作用于 MCF7 细胞. 化合物浓度是 10 μM, DZXX 浓度是100 μg/mL. 干预时间是12小时，2个重复样本。获得在DZXXI, apigenin, apigenin-7-o-glucuronide, quercetin-3-o-glucuronide 干预下，差异表达基因分别有87, 169, 49, 47个.

4. DZXX重要靶标的识别

 DZXX 的靶基因与缺血性中风的疾病基因和药物靶标的交集中有2个基因（Fig 2）：PTGS1 (Prostaglandin G/H synthase 1) 和PTGS2 (Prostaglandin G/H synthase 2),  因此它们是DZXX抗缺血性中风的重要靶标。DZXX有4个化合物caffeic acid, apigenin, quercetin-3-O-glucuronide 和 kaempferid-3-o-glucuronide靶向这2个靶标。

Figure 2 不同基因集的交集. 

(A) 多个疾病基因集和抗缺血性中风药物靶标的交集 (B) DZXXI 的靶基因与缺血性中风疾病基因集、药物靶标集的交集

5. 识别DZXX干预的重要信号通路

     通过通路分析发现，DZXX的靶标主要分布在与抗血小板凝结相关的信号通路上（见Fig3C,D中红色方框），说明DZXX抗缺血性中风的作用可能主要是通过抗血小板凝结实现的。进一步的通路富集分析发现，DZXX的靶标富集在3个信号通路上（Fig 4）：“NF-kappa B signaling pathway”, “TNF signaling pathway”, “PI3K-Akt signaling pathway”. 这3个信号通路和神经损伤密切相关，说明DZXX可能具有神经保护作用。

Figure 3 抗缺缺血性中风药物和DZXX的药物、靶标以及通路的关系网络。

(A) DZXX的活性化合物的药物-靶标网络 。(B) KEGG中抗缺血性中风西药的药物-靶标-通路网络，其中最重要的抗凝血和抗血小板通路用深蓝色框标示。 (C) DZXX潜在靶标的靶标-通路网络。显著富集靶标的通路用黑色框标示。(D) DZXX干预下差异表达基因的基因-通路网络。

Figure 4 DZXXI的潜在靶标在TNF 信号通路上富集.

6. 识别被DZXX的靶标显著抑制的基因、分析这些基因的功能

利用符号网络上的随机漫步重起算法，识别到被DDXX靶标所显著抑制的基因216个，这些基因在中风的疾病基因集、抗缺血性中风的西药靶标中显著富集，说明了DZXX具有抗缺血性中风的作用。

接下来，对DZXX靶标所显著抑制的216个基因进行功能分析，发现：（1）这些基因显著富集在炎症、缺血性疾病、中风等疾病类别上（Table 1）; (2) 这些基因在大脑和血小板中显著富集表达（Table 2）；（2）这些基因在抗血小板凝结相关信号通路上显著富集（Fig 5）.

Table 1 显著富集DZXX靶标和DZXX干预下差异表达基因所显著抑制基因的疾病类。 

Seeds	Enrichment Score/Rank	Disease term	Mapped genes	Total genes	Percent	p-value
Targets	10.88/1	Infection|Inflammation|Premature Birth	18	125	8.49%	1.02E-11
Inflammation|Premature Birth	18	128	8.49%	1.50E-11
Connective Tissue Diseases|Fetal Diseases|Inflammation| Musculoskeletal Diseases|Pregnancy Complications, Hematologic|Premature Birth|Skin Diseases	18	128	8.49%	1.50E-11
10.21/2	Brain Ischemia|Hypertension|Osteoporosis|Stroke	14	64	6.60%	1.60E-11
Coronary Artery Disease|Inflammation	12	40	5.66%	1.73E-11
Brain Ischemia|Inflammation|Stroke	11	33	5.19%	5.02E-11
Chlamydia Infections|Inflammation|Trachoma	11	33	5.19%	5.02E-11
Inflammation|Venous Thromboembolism	10	33	4.72%	1.37E-09
Diff Genes	6.73/3	Inflammation|Premature Birth	14	128	6.80%	5.22E-08
Connective Tissue Diseases|Fetal Diseases|Inflammation| Musculoskeletal Diseases|Pregnancy Complications, Hematologic|Premature Birth|Skin Diseases	14	128	6.80%	5.22E-08
Infection|Inflammation|Premature Birth	12	125	5.83%	2.40E-06
2.62/4	Coronary Artery Disease|Inflammation	6	40	2.91%	2.91E-04
Brain Ischemia|Inflammation|Stroke	5	33	2.43%	0.001361
Inflammation|Venous Thromboembolism	5	33	2.43%	0.001361
Chlamydia Infections|Inflammation|Trachoma	4	33	1.94%	0.012572

Table 2  DZXX靶标和DZXX干预下差异表达基因所显著抑制基因的组织表达富集分析

Seeds	Category	Term	Mapped genes	Total genes in tissue	p-value
Targets	GNF_U133A_QUARTILE	Whole Brain_3rd	91	3978	3.05E-06
CGAP_SAGE_QUARTILE	29:vascular_endothelium_3rd	28	1487	0.004141
UP_TISSUE	Platelet	22	579	1.78E-06
Diff genes	UP_TISSUE	Platelet	16	579	0.001067
CGAP_SAGE_QUARTILE	429:vascular_normal liver_3rd	29	1442	0.001204
GNF_U133A_QUARTILE	Whole Brain_3rd	71	3978	0.015666

Figure 5 DZXX靶标(A)和DZXX干预下差异表达基因(B)所显著抑制基因富集的信号通路。其中红、绿字体分别表示被抗血小板和抗凝血类西药干预的信号通路，蓝色字体代表同时被这2类西药干预的信号通路。

7. 识别与DZXX具有相似效应的西药

    通过CMAP分析，找到作用于细胞后与DZXX具有相似表达谱的西药，其中名列前茅的许多是与治疗中风相关的（Table 3）, 说明了DZXX也具有相似的抗中风的效果。

Table 3  CMAP分析得到的与DZXX干预具有相似表达谱的、与抗中风相关的药物.

Treatment	Rank	CMAP Chemical	Cell line	Score	Pharmacological usage of the chemical
DZXXI	2	Cyanocobalamin	MCF7	0.959	Atherosclerosis Intervention；Prevention of Stroke
3	Isoxicam	HL60	0.932	Anti-Inflammatory Agents, Non-Steroidal
5	Raubasine	MCF7	0.918	Vasodilator Agents
6	Parthenolide	PC3	0.91	Anti-Inflammatory Agents, Non-Steroidal
14	Lanatoside C	PC3	0.876	Cardiac glycosides
15	Kaempferol	HL60	0.868	Anti-Inflammatory
20	Ketorolac	HL60	0.841	Anti-Inflammatory Agents, Non-Steroidal
28	Rescinnamine	MCF7	0.8	Antihypertensives
39	Quercetin	HL60	0.772	Antioxidants
150	Apigenin	MCF7	0.655	Inhibition of cyclooxygenase-2 expression
Apigenin	1	Aminophylline	MCF7	1	Cardiotonic Agents
2	Phenoxybenzamine	MCF7	0.88	Antihypertensive Agents
3	Rosiglitazone	PC3	0.878	Hypoglycemic Agents
6	Luteolin	MCF7	0.853	Anti-Inflammatory
7	Benzthiazide	HL60	0.837	Antihypertensive Agents
11	Glimepiride	PC3	0.807	Hypoglycemic Agents
13	Vincamine	PC3	0.803	Antihypertensive Agents
226	Apigenin	MCF7	0.581	Inhibition of cyclooxygenase-2 expression
Apigenin-7-o-glucuronide	4	Tolazamide	PC3	0.852	Hypoglycemic Agents
6	Phenindione	MCF7	0.842	Anticoagulants
7	Gliclazide	MCF7	0.821	Hypoglycemic Agents
8	Bromopride	MCF7	0.816	Dopamine Antagonists
9	Benzamil	MCF7	0.805	Antihypertensive
10	Laudanosine	MCF7	0.805	Central Nervous System Agents
278	Apigenin	MCF7	0.603	Inhibition of cyclooxygenase-2 expression
Quercetin-3-O-glucuronide	3	Acenocoumarol	HL60	0.912	Anticoagulants
6	Sparteine	MCF7	0.861	Anti-Arrhythmia Agents
7	Ketoprofen	PC3	0.861	Anti-Inflammatory Agents, Non-Steroidal
13	Suloctidil	PC3	0.847	Vasodilator Agents
14	Ajmaline	MCF7	0.843	Anti-Arrhythmia Agents
15	Procainamide	MCF7	0.84	Anti-Arrhythmia Agents
16	Amrinone	MCF7	0.835	Cardiotonic Agents
23	Triamcinolone	HL60	0.814	Anti-Inflammatory Agents
28	Phentolamine	MCF7	0.806	Antihypertensive Agents
157	Quercetin	HL60	0.67	Antioxidants

8. 实验验证

通过相应的计算机模拟实验、体内、体外和动物实验，验证了网络药理学的分析结果。实验验证结果如下：

（1）DZXX的活性化合物caffeic acid, apigenin, quercetin-3-O-glucuronide ，kaempferid-3-o-glucuronide对蛋白PTGS1, PTGS2有抑制作用（Fig 6A~E，I）。

 （2）DZXX和 caffeic acid显著抑制血小板凝结， apigenin 和 quercetin–3–O- glucuronide 轻微抑制血小板凝结（Fig 6 F,G）。

 （3）DZXX显著减小MCAO模型鼠的脑部梗死面积，说明其具有神经保护作用(Fig6 H)。

Figure 6 DZXX的重要靶标和作用效果的实验验证。

 (A~B) DZXX的4个化合物与2个重要靶标PTGS1 (A)和 PTGS2 (B) 的虚拟结合强度的分子对接分。(C~E) DZXX的3个活性化合物对PTGS1/2 的抑制活性，以及caffeic acid 与 PTGS1的结合亲和度的实验结果。(F~G) DZXX及其3个活性化合物的抗血小板凝结活性的实验结果。(H) DZXX对大脑中动脉闭塞模型鼠的神经保护作用的实验结果(I) DZXX对thromboxane B2 (TXB2)水平的影响的实验结果. 

9. 结论

   通过网络药理学分析，发现DZXX抗缺血性中风的机制是：

（1）通过4个活性化合物caffeic acid, apigenin, quercetin-3-O-glucuronide ，kaempferid-3-o-glucuronide抑制与血小板聚集相关的蛋白PTGS1, PTGS2，起到抑制血小板聚集的作用。重要靶标得到计算机模拟和体外实验验证的证实。

 （2）DZXX的靶标在与神经元增殖、生长、代谢和存活相关的3个信号通路PI3K-Akt， TNF， NF-kB信号通路显著富集 ，说明DZXX具有神经保护作用。神经保护作用得到动物实验验证。

（3）被DZXX的靶标显著抑制的基因富集在与抗血小板聚集相关的信号通路上，说明DZXX具有抑制血小板聚集的作用。DZXX的这个效果得到体外实验的验证。

（4）被DZXX的靶标显著抑制的基因富集炎症、缺血性疾病、中风类疾病相关的基因，并在大脑、血小板中显著表达，说明DZXX对缺血性中风有治疗效果。

（5）DZXX干预后细胞的基因表达谱与许多与抗中风相关的药物干预后细胞的表达谱有很高的相似度，说明DZXX有抗中风的作用。

第13期全国中药网络药理学的研究策略

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武汉班：2019/9/7-8（6号报到）武汉长江大酒店

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1. 2个最新的中药数据库，比以前的数据库包含更多的信息，使用更方便，对各个中药数据库的比较及优点、缺点的评价

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3. 批量进行不同物种同源基因映射的方法

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背景简介

传统中药历史悠久，在治疗复杂慢性疾病方面具有独到的疗效和较小的毒副作用。但中药存在成分复杂、机制不清的问题，阻碍了中药的现代化和国际化。中药的物质基础和作用机理，尚需应用现代医学和生物科学技术，进行深入的研究。近年来，将系统生物学的思想和方法应用于中药研究中，正成为一种新的趋势。中药网络药理学已发展成为一个新的交叉学科，它将网络科学、生物信息学、计算机科学和数学等学科的方法结合到中药药理的研究中，从分子水平和分子网络调控的背景中阐明中药的作用机理。通过中药网络药理学的方法，可望使中药的理论研究和临床应用更加科学严谨，逐渐得到世界的认可。

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课程安排

两天的课程安排：

第一天上午：中药网络药理学简介

1. 网络药理学的发展历程和研究现状简介

2. 中药网络药理学SCI论文的详细剖析

3. 中药网络药理学的核心问题

4. 中药网络药理学的研究路线

第一天下午：中药网络药理学研究的数据来源

1. 中药有效成分的查找

常用中药数据库及使用方法

2. 中药有效成分的靶点查找及靶点预测

（1） 化合物结构信息的查询

（2） 用中药数据库查询化合物靶点

（3） 用药靶数据库查询化合物靶点

（4） 用化合物结构相似性预测化合物靶点

（5） 基于药效团模型预测化合物靶点

（6） 用分子对接验证化合物靶点

3. 疾病相关基因的查找及获得

（1） 用数据库查询疾病相关基因

（2） 分析GEO数据库中的基因芯片数据，获取疾病相关基因

第二天上午：网络药理学的实用技能介绍（一）

1. 基因ID转换

2. 用DAVID进行GO富集、通路富集、tissue富集、疾病基因富集分析

3. 用Connectivity Map分析药物机制

4. 基因功能相关网络构建

5. 基因共表达网络构建

第二天下午：网络药理学的实用技能介绍（二）

1. 全基因组网络数据获取

2. 利用Cytoscape软件构建和分析网络：网络构建；基本拓扑特征的计算；重要节点识别；网络拓扑指标的含义；模块分解；子网络提取；网络可视化；数据输入输出；图形导出；Cytoscape插件的安装和使用等

3. 药物影响的子网络的构建

4. 常用图形绘制方法介绍

5. 一篇5分SCl论文中全部分析结果的重现

6.网络药理学相关基金申请及课题设计。

6. 课程总结

备注：自带笔记本电脑，安装WINDOWS 64位操作系统，提前一周发放软件以及安装信息

培训时间和地点

武汉班：2019/09/07-08（06号报到）武汉长江大酒店

上海班：2019/10/19-20号（18号报到）上海华晶宾馆

学习班主办：医药加科研培训中心

学习班承办方：上海遐永医药科技有限公司

收费标准

3000元/每位（注册费包含电子版教材、午餐，住宿费自理。）

优惠政策：

1. 提前确认报名及转账的，可以提前拿到学习材料与发票

2. 三人组团报名，每人优惠100元

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5.  再加500元服务费，可以复听第二次

可以开正规会务发票，纸质邀请函（盖红章）。

此图为主讲老师正在指导学员

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联系人：王老师 13818765978， 金老师 18917745941

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