[连载3] 胶质瘤的细胞免疫治疗（脑胶质瘤基础与临床研究 ）

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本文摘自人民卫生出版社出版的《脑胶质瘤基础与临床研究》，作者刘福生、金贵善；《神外前沿》发布此文，已获出版社书面授权及作者本人许可。

第二节  胶质瘤细胞免疫治疗

细胞免疫治疗需要相应的免疫细胞介导并且肿瘤细胞表面表达 MHCI (major histocompatibility com¯ plex I) 型分子，从而递呈胶质瘤特异性抗原。许多胶质瘤细胞表面可以表达 MHCI型分子以及 α 微 球蛋白，提示胶质瘤抗原递呈通路存在于胶质瘤细胞系中并且具有功能。 因此胶质瘤细胞可以作为免疫治疗的靶点。尽管体内条件下胶质瘤细胞只表达低水平的 MHCI分子，然而加以适当的细胞因子 (如IFN¯β) 刺激，其表达水平可以得到显著提升。T 细胞可以识别胶质瘤细胞释放的肿瘤相关抗原( tumor¯ associated antigens，TAAs)。TAAs 具有免疫原性，它仅仅在机体的胎儿发育时期或者是免疫耐受位点表达，往往包含一个通过基因突变重排形成的新的肽片段。

一、 以抗原提呈细胞为基础的免疫治疗

T 淋巴细胞介导的细胞免疫在抗肿瘤免疫应答过程中起到了重要作用。成功的免疫治疗需要免疫系 统首先识别肿瘤细胞。抗原提呈细胞 (antigen presentation cell.APC) 可以将肿瘤特异性抗原递呈给 T淋巴细胞并激活它们的抗肿瘤活性。外周血液循环中的 APC 细胞包括 B 淋巴细胞、 骨髓来源的树突状 细胞和巨噬细胞。树突状细胞 (dendritic cell.DC) 具备强大的抗原递呈能力并能够初始化及控制相应 免疫应答.因其成熟时伸出许多树突样或是伪足样突起而得名 (图 6¯1)。树突状细胞通过胞吞作用捕 获抗原.在炎症促进因子等作用下.树突状细胞将抗原特异性多肽片段递呈给位于细胞表面的 MHC 分 子.并增强其 T 细胞激活能力。这时 DC 细胞会转化为成熟的 DC 细胞.并高表达I型及II型 MHC 分子 以及 T 细胞活化所需的共刺激分子。成熟的 DC 细胞会向淋巴结移行并激活 T 淋巴细胞。随着 DC 细胞体外分离和培养技术的发展及成熟 DC 细胞介导的肿瘤疫苗技术的改进.胶质瘤的治疗将会有更好的发展。

树突状细胞是目前发现的功能最强的抗原提呈细胞. 具有其他抗原提呈细胞所不具有的特性.如: 具有表达、 摄取、 转运抗原的特殊膜受体的能力.能有效摄取和处理抗原.然后迁移至 T 细胞区域.能 高水平表达 MHCII (major histocompatibility complexII) 类分子.能活化未致敏的 T 细胞.用少量的抗 原和少量的树突状细胞即可激活 T 细胞.抗原提呈效率高. 树突状细胞在胶质瘤的治疗中也发挥重要作 用. 从小鼠骨髓中分离出干细胞再经过体外 GM¯ CSF 和 IL¯ 4 的刺激.扩增得到树突状细胞.经体外刺 激活化后回输到小鼠体内.可显著延长小鼠生存期. 如果将致敏 DC 注入体内.发现 DC 疫苗的 CTL 活 性明显增强.并且 DC 细胞对荷瘤鼠有明显的免疫抑制作用.能够延长动物生存期. 

以抗原提呈细胞为基础的免疫治疗需要有效地激活胶质瘤特异性细胞毒性 T 淋巴细胞. 早期注射整 个自身胶质瘤细胞后并没有引起相应免疫反应.原因可能是相应的特异性抗原并没有被有效地递呈给 T 淋巴细胞以至于免疫系统不能对肿瘤细胞加以识别. 另外一种状况是大多数胶质瘤细胞同时表达各种免 疫抑制因子.不表达或极少表达II型 MHC 分子和共刺激分子.这使得胶质瘤细胞的抗原递呈作用微弱.从而治疗效果不佳. 现在往往通过基因工程学方法处理肿瘤细胞使其表达细胞因子或共刺激分子.从而 增加肿瘤免疫治疗的疗效. 

各种胶质瘤抗原致敏的树突状细胞都可以诱导肿瘤抗原特异性免疫反应. 致敏原包括肿瘤细胞表面 肽片段、 肿瘤裂解液、 肿瘤细胞总 RNA 等. 肿瘤特异性抗原编码基因也可以致敏 DC 细胞. 应用自体肿 瘤细胞表面来源蛋白肽段或者肿瘤细胞裂解液致敏 DC 细胞后制备疫苗.可以诱导产生肿瘤抗原特异性 T 细胞.使患者生存期延长. 以上这些治疗策略相对安全.患者耐受力良好.而且并没有发现明显的毒 副作用. 

应用整个肿瘤细胞致敏树突状细胞 (DC) 也是一种有效的治疗途径. 应用 DC/ 胶质瘤融合细胞联 合应用 IL¯12 可以延长脑肿瘤荷瘤鼠的生存期. DC 细胞与 TGFβ1 及反义 TGFβ1 基因修饰的胶质瘤细胞 融合后的细胞疫苗可显著抑制胶质瘤细胞的生长. 另外.我们的研究也表明.C6 胶质瘤细胞与树突状 细胞融合后.融合细胞的体积较大.融合细胞中既可以看到树突状细胞的叶状突起.又可以看到 C6 细 胞的微绒毛 (图6¯2). 融合后的细胞更好的发挥了树突状细胞的抗原提呈作用. 

在 DC / 胶质瘤融合细胞免疫治疗I期临床试验中.外周血淋巴细胞 IFN 分泌水平增高.肿瘤体积缩 小. 但是胶质瘤细胞基因组的不稳定性以及免疫治疗选择性压力.使得胶质瘤抗原会逐渐发生突变.新生抗原也会随着胶质瘤发展不断改变. 因此人们开发出了 DC 细胞原位摄取肿瘤相关抗原的治疗策略.包括肿瘤组织内直接注射 DC 细胞或通过细胞因子及相应配体于肿瘤组织局部募集 DC 细胞等. 此外在 其他一些免疫治疗策略中研究者应用 GM¯ CSF、 Flt3L (Fms like tyrosine kinase 3 ligand.酪氨酸激酶受体 3 配体) 等作为免疫佐剂募集更多的 APC 细胞到疫苗注射部位以增强疗效. 树突状细胞应用于胶质瘤的 免疫治疗仍然存在着许多问题.如功能维持时间短、 与肿瘤抗原肽结合能力差、 树突状细胞数量的扩增 缓慢以及存在免疫逃避等. 这些问题都将成为未来研究的重要方向. 

应用 DC 介导的免疫疗法具有一定潜在危险性.可能会产生自体免疫反应. 解决的方法是应用只表 达于肿瘤组织而不表达于正常脑组织的肿瘤特异性抗原相关肽致敏 DC 细胞. 应用合成肽片断致敏的 DC 细胞治疗颅内肿瘤可产生有效的抗肿瘤活性. 研究表明胶质瘤相关抗原 IL13R 2 相关肽可以激活 IL13R 2 特异性 CTL. 另一方面.EGFRvIII在胶质母细胞瘤中过度表达而没有在正常脑组织中表达.因 此是一种理想的免疫治疗靶点. 

肽疫苗不需要体外培养肿瘤细胞以及体外致敏 DC 细胞.然而由于胶质瘤细胞的异质性复杂.应用 单一的胶质瘤抗原相关肽疫苗治疗未必能改善患者预后.因此我们需要发现和鉴定更多的肿瘤抗原相关 T 细胞表位以用于肽疫苗制备. 

小胶质细胞具有潜在的抗原递呈功能.研究表明胶质瘤组织中也浸润有大量的小胶质细胞. 目前已 证实在体外环境下小胶质细胞具有一定的递呈肿瘤抗原的能力.而在体内环境下却和未成熟 DC 细胞一 样仅表达低水平的I型和II型 MHC 分子及共刺激因子. 这致使胶质瘤产生免疫耐受. 研究者发现胶质 瘤中浸润型小胶质细胞是 IL¯10 因子以及 Fas 配体的主要表达所在. 在胶质瘤中.这些免疫抑制细胞因 子及淋巴细胞毒性配体的表达可能是造成胶质瘤局部免疫作用被抑制的主要原因之一. IFN 或 CpG 寡核 苷酸能够激活体内包括小胶质细胞在内的抗原递呈细胞.激活后小胶质细胞可以具备抗原递呈能力.在 免疫防御和杀伤肿瘤中起到相应作用. 但某些细胞因子如 GM¯ CSF 虽然能够激活小胶质细胞但同时它也 可以增加胶质瘤细胞的迁移能力导致疾病诊治更加困难. 

二、 效应细胞为基础的免疫治疗 

在胶质瘤患者中发现广泛的免疫系统缺陷包括 T 细胞数量下降. T 细胞反应能力缺损. 早期 T 细 胞受体跨膜信号传导受损等. 因此在高级别胶质瘤患者体内激发强有效的抗肿瘤免疫反应具有一定 的难度. 而过继性免疫治疗则是可行方案. 有研究者报道过继性输送肿瘤致敏的淋巴细胞后. 该细 胞可以向颅内肿瘤移行并且产生抗肿瘤效应. 这些细胞会自然识别细胞表面的异常. 如低表达的 MHC I类分子或者是细胞表面糖原表达. T 细胞依靠细胞表面的 MHC 分子来识别异常肽段的表达. 当 T 细胞可以识别在肿瘤组织或其他组织特定的肿瘤抗原时. 因为其表达频率低. 所以免疫反应比 较弱. 选择应对的一种方法是将 T 细胞首先在体外激活. 这样可以克服体内抑制因子的作用. 从而 增加抗肿瘤的活性ꎻ 另外一种方式是在输入活性细胞前通过控制宿主的状态以提供转 细胞最佳的 微环境来改善免疫治疗效果. 

一些免疫效应细胞包括自然杀伤细胞 (natural killer cell. NK 细胞)、 淋巴因子激活的杀伤细胞 (lymphokine¯activated killer cell. LAK 细胞)、 自然杀伤 T 细胞 (natural killer T cell. NKT 细胞)、 细胞 毒性 T 淋巴细胞 (cytotoxic lymphocyte. CTL 细胞)、 肿瘤浸润淋巴细胞 (tumor infiltration lymphocyte. TIL) 等均已被用于胶质瘤的治疗. 目前. 研究人员多使用患者自身的免疫细胞. 通过细胞因子在体外 活化. 再回输入患者体内. 如使用 CD3 与 IL¯2 以及人身皂苷、 CD3 与 IL¯2 协同诱导外周血单个核细 胞 (peripheral blood mononuclear cell. PBMC). 结果都显示多种细胞因子同时应用具有协同效应. 能 够使 CD3 + NK 细胞 (natural killer cell) 成为较本身增殖能力更强、 杀伤活性更强的免疫效应细胞. 通过体外培养人胚胎胸腺细胞 (embryonic thymus cell. ETC). 比较不同来源 LAK 细胞、 活化人胚胎 胸腺细胞联合对 TJ905 人脑胶质瘤细胞的体外作用效果. 发现单独人胚胎胸腺细胞在体外对胶质瘤细 胞无抑制作用. 而不同来源 LAK 细胞和活化人胚胎胸腺细胞联合对 TJ905 细胞具有杀伤作用. 使用 过继性免疫治疗方法治疗胶质瘤关键是获得足够的杀伤活性强的免疫活性细胞. 目前主要使用的 LAK 细胞、 CIK 细胞等静脉注射或局部应用. 因其数量有限、 杀伤活性低下等缺陷限制了其在临床中 的应用与发展. 

NK 细胞、 LAK 细胞及 NKT 细胞是抗原非依赖性自然杀伤细胞. LAK 细胞是 NK 细胞或淋巴细胞体 外培养时. 在高剂量 IL¯ 2 等细胞因子诱导下转变为杀伤能力更强的细胞. 能够杀伤对 NK 不敏感的肿瘤 细胞. 主要由 CD3¯ CD56 + NK 细胞组成. NKT 细胞是一群细胞表面既有 T 细胞受体又有 NK 细胞受体的 特殊 T 细胞亚群. 具有桥接固有免疫和获得性免疫的能力. 这些自然杀伤细胞可以发挥杀伤作用. 而不 受 MHC 类型的限制. 在安全性方面有人报道注射经体外培养扩增的 NK 细胞是安全的. 且在复发胶质 瘤患者中具有一定的治疗效果. 然而由于 NK 细胞作用非特异性、 效应低及杀伤作用时间短等因素. 临 床上应用自然杀伤细胞治疗的效果有限. 虽然如此 NK 细胞可以与肿瘤特异性过继性免疫治疗联合应用 而发挥疗效. 

CTL 细胞、 TIL 细胞及自体肿瘤特异性 T 淋巴细胞 ( autologous tumor¯ specific T lymphocytes. ATTLs) 属于肿瘤抗原特异性淋巴细胞. CTLs 是 CD8 + T 淋巴细胞. 可以特异性杀伤肿瘤. 受 MHCI类型限制. TILs主要由CTLs组成. 可以识别肿瘤细胞表面特异性抗原/MHCI复合物. 且能够从患者肿瘤组织中加 以分离和扩增. CTLs 在肿瘤的排斥反应中扮演了至关重要的角色. 很多实验证实 CTLs 的抗胶质瘤治疗 有效. 然而 CD8 + CTLs 单独并不能治疗胶质瘤. 需要 CD4 + T 细胞加以辅助. 研究显示当缺乏 CD4 + T 淋 巴细胞时. 抗肿瘤免疫治疗的效果完全丧失. 这说明 CD4 + T 淋巴细胞在胶质瘤的免疫治疗中起到了重 要的作用. ATTLs 自体肿瘤特异性 T 淋巴细胞由 CD4 + 和 CD8 + 细胞组成. 当肿瘤细胞经 X 射线照射后 或抗原靶点经甲醛固定后. 外周血单核细胞来源的 ATTLs 被激活. 需要收集足够多的靶细胞来刺激 AT¯ TLs 增殖. 这在一定环境下限制了其临床使用. 随着越来越多的肿瘤相关抗原被分离鉴定. 可以在体外 环境中提供大量的激活的 CD4 + 和 CD8 + T 细胞输注到胶质瘤患者体内进行治疗. 相信 CD4 + 和 CD8 + T 细胞及 NK 细胞联合应用其治疗效果会得到进一步提升. 

现今的胶质瘤细胞治疗已经逐步由非特异性治疗转向特异性治疗. 应用最多的是细胞毒性 T 淋巴细胞 (cytotoxic T lymphocytes. CTLs) 以及嵌合抗原受体 (chimeric antigen receptor. CAR) 修 饰的 T 细胞. CAR 修饰 T 细胞是将识别肿瘤相关抗原的单链抗体和 T 细胞的活化基序结合为一体. 即将抗体对肿瘤抗原的高亲和性与 T 淋巴细胞的杀伤机制相结合. 通过基因转导方法转 T 细胞. 使其具有特异性识别并杀伤肿瘤细胞的能力 (图 6¯3). T 细胞通过抗原特异性 T 细胞受体 (anti¯ gen¯ specific T¯ cell receptor. TCR) 识别靶标. 并且抗原通过匹配的 MHC 分子提呈时. T 细胞激活 并杀伤靶细胞. CTL 治疗依赖于相应的肿瘤相关抗原的存在 (tumor¯associated antigens. TAAs). 肿瘤相关抗原 ( TAAs) 经加工并通过抗原提呈是 T 细胞激活的前提条件. 病毒性的抗原以及肿瘤 相关抗原 (TAAs) 都有此作用. 许多 TAAs 已经确定是有效的胶质瘤治疗靶标并在进行具体的临 床应用开发. CD133 是胶质瘤 CTL 治疗中让人感兴趣的 TAA 之一. CD133 + 的 CTLs 对胶质瘤干细 胞具有治疗效果. 通过原位杂交的方法显示. 大部分胶质瘤患者细胞中表达巨细胞病毒 (cytomeg¯ alovirus. CMV) 免疫蛋白 pp65 以及 IE1¯72. 提取 CMV 血清反应阳性的 GBM 患者的特异性细胞毒 性 T 淋巴细胞 ( CTLs) 并在体外扩增. 此细胞可以识别并杀伤表达 CMV 的自体肿瘤细胞. 相应的 CMV 特异性细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTLs) 作为临床治疗在I期临床试验中 (NCT00693095. NCT01205334. NCT01109095). 

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