不了解单细胞分离的科研人员不是一个好司机
细胞是生物结构和功能的基本单位，同时细胞异质性是生物组织的普遍特征，因此基于单细胞的生命科学研究能从更深层次上揭示生命活动的本质和规律，为研究生物发育、疾病发生发展及治疗等提供可靠的数据。
一个完整的单细胞测序过程包括单细胞分离、基因组或转录组大量扩增、测序及数据分析4个主要步骤，随着扩增和测序技术的成熟，单细胞分离对于最终数据质量的影响引起越来越多的关注。单细胞测序作为一项新兴技术，刚接触这个领域的研究者经常会遇到以下问题：
今天科技君请小伙伴根据自身的单细胞分离经验对以上问题进行解答，同时将一些常见的单细胞分离平台的特点和适用范围呈现给大家，总会有一款是属于你的单细胞分离平台。
01
口吸法
首先介绍的是不需复杂设备即可进行单细胞分离的一种技术――口吸法。顾名思义，这种技术是通过对呼吸力道的控制，在倒置显微镜下利用毛细管辅助手工的分离操作，将活力好的单细胞分离到单细胞裂解液里面。
优点
这种分离方式温和、精确，每个待选细胞状态在显微镜下一清二楚；
对细胞的损伤可以忽略不计，后期的扩增建库成功率非常高；
同时仅需简单的设备、耗材。
缺点
口吸法对于操作人员的熟练度要求非常高，需要一定的训练才能熟练掌握这种技术，
分离的通量也“因人而异”，不过对于有着多年分离经验的华大科技团队来讲，这些都是“小菜一碟”了。
综合评价
通量：★★★
操作难度：★★★
细胞完整性：★★★★★
02
显微切割
机体组织一般包含大量不同类型的细胞，这些细胞往往与周围的细胞、基质、血管、腺体、免疫细胞等等粘附在一起，当研究其中特定类型的细胞时，为了排除背景干扰，需要预先将这部分细胞进行分离，这时就要借助显微切割技术了。用于显微切割的组织切片可以是冰冻切片、石蜡包埋组织或者细胞涂片。
优点
可从构成复杂的组织中获得某一特定同类细胞或单细胞，尤其适合肿瘤分子生物学研究。
缺点
手工切割操作难度大，而激光切割设备昂贵；
另外组织固定、染色及切割过程中对细胞损伤大，
分离的细胞多不能满足下游的建库测序分析。
综合评价
通量：★★
操作难度：★★★★★
细胞完整性：★
03
WaferGen平台分离
目前隶属于Takara Bio的WaferGen生物系统公司于2014年推出了基于SmartChipTM平台的单细胞分析技术，系统中整合了单细胞分离及扩增，在包括RNA测序在内的样本下游处理中取得了不错的结果。这套系统通过将制备好的悬浮细胞均匀的稀释到纳米级别的反应孔中来完成单个细胞的分离，目前每次最多可以完成1800个单细胞的分离。华大基因作为首批配备此平台的用户，已经利用WaferGen平台完成多个科研合作项目，积累了丰富经验。
优点
通量大，短时间内完成大量细胞的分离、扩增
缺点
单次反应耗材成本略高
综合评价
通量：★★★★
操作难度：★★★
细胞完整性：★★★★
04
流式细胞仪分离
而对于复杂样本中特定细胞类型的分离就往往要借助流式细胞仪来进行分离了。经过荧光或者抗体标记的单细胞悬液在鞘液的包裹或推动下，以一定的速度从流动室喷出。在超高频压电晶体下，喷出的液流形成液滴并在高压电场影响落入各自的收容器，从而实现细胞的分离。
优点
通量大，短时间内从复杂样本中分离大量的目的细胞
缺点
细胞悬液前处理时间长；仪器操作需要较高的熟练度；对细胞的伤害比较大
综合评价
操作难度：★★★★
通量：★★★★★
细胞完整性：★★★
另：根据经验，经过流式分离的细胞活性一般很少超过半小时，所以对于流式分离后的样本，小伙伴们最常唠叨的一句就是——赶紧进行下一步反应！
05
微流控分离
最近几年随着科技的发展，微流控技术在单细胞分离领域迅速应用，其中名气最大的当属富鲁达公司（Fluidigm）2012年推出的C1™ 单细胞全自动制备系统以及2015年10X Genomics公司推出的Chromium™单细胞系统。
C1™系统首先通过移液操作，将溶液中的细胞样品加在C1™微流体芯片上， C1™系统在输入的指令下会快速自动分离出 96 或384个单细胞并分配到单个制备仓中；之后在芯片上进行细胞裂解、RNA反转录及预扩增。
优点
通量高，单个细胞成本低
缺点
设备昂贵、目前仅限单细胞RNA方面
综合评价
通量：★★★★
操作难度：★★★
细胞完整性：★★★★
Chromium™单细胞系统通过将单个细胞、反应试剂以及含有不同分子标签的磁珠一起，被包被在一个油滴中形成油包水的结构，最终每个细胞的cDNA分子携带了不同的分子标签，从而达到区分单个细胞的目的。Chromium™单细胞系统由于其原理设计上的优势，单位时间内可以分离的单细胞数量更大，可以达到上万个细胞同时分离、扩增，由于每个细胞携带不同的分子标签进行区分，后续可以允许多个细胞同时在一个反应体系中扩增，其消耗的试剂量更低，最终折合到每个单细胞的费用极低，所以这套系统一经面世便引起了轰动，华大也在第一时间内引进了这套系统，经过各项测试后已经对外发布相应的服务。
优点
通量高，单个细胞成本极低
缺点
设备较贵、目前仅支持RNA 3’端测序
综合评价
操作难度：★★★
通量：★★★★★
细胞完整性：★★★★
显而易见，基于微流控的技术，在单细胞分离、扩增上原理上具有明显的优势，不过这些设备可都不便宜；另外虽然单个细胞的费用比较低，但是也需要较多的经费支持单次进行如此大量的单细胞研究。
我们
作为一直在高通量测序研究领域走在前列的机构——华大基因，多年来在单细胞分离、建库领域的技术开发、应用中积累了丰富的经验，目前已经拥有包括口吸法、WaferGen、流式分离、Chromium™单细胞分离的多个高、低通量的分离、建库平台以及对应的解决方案。同时具备多种细胞和组织分离的经验——包括Hela细胞、胚胎干细胞、神经元细胞等细胞类型和脾脏、心脏、肌肉、肾脏、肺等组织类型。华大股份也是国内高通量领域内首家也是目前唯一一家提供低通量的口吸法单细胞分离和高通量的Chromium™单细胞分离系统解决方案的公司，相信我们专业的服务定能为您的科研研究锦上添花。
附上华大发表过的单细胞文章
[1] Hou, Y., Song, L., Zhu, P., Zhang, B., Tao, Y., Xu, X., Li, F., Wu, K., Liang, J., Shao, D., et al. (2012). Single-cell exome sequencing and monoclonal evolution of a JAK2-negative myeloproliferative neoplasm. Cell. 148, 873-885.
[2] Xu, X., Hou, Y., Yin, X., Bao, L., Tang, A., Song, L., Li, F., Tsang, S., Wu, K., Wu, H., et al. (2012). Single-cell exome sequencing reveals single-nucleotide mutation characteristics of a kidney tumor. Cell. 148, 886-895.
[3] Zhang, C., et al. (2013).A single cell level based method for copy number variation analysis
by low coverage massively parallel sequencing. PLoS One.;8(1):e54236.
[4] Yin, X.Y., et al. (2013). Massively parallel sequencing for chromosomal abnormality testing in
trophectoderm cells of human blastocysts. Biology of Reproduction. 88(3):69.
[5] Yu C, et al. ( 2014). Discovery of biclonal origin and a novel oncogene SLC12A5 in colon cancer
by single-cell sequencing. Cell Research. 24(6):701-12.
撰稿：徐怀前 王云飞 吴蔚瑶
编辑：市场部
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