玩转14000年前古基因组 | BGISEQ-500 WGS版盗墓笔记

近期BGISEQ-500平台屡创佳绩，有了Freestyle之后 ，又有了新文章。

这一次，不是寻常的样本，而是从

考古材料、古生物化石、生物遗体、遗迹、及沉积物中

取得的古代生物DNA分子。

今日，请走进BGISEQ-500 WGS版盗墓笔记！

导读

古DNA是指从考古遗迹和古生物化石标本中获取的古生物的遗传物质^[1]。古DNA由于在漫长年代中长时间的水解作用、氧化作用及环境微生物降解作用等而严重降解^[2]，核DNA片段一般不超过150bp^[3]。而残存的片段内部还广泛存在单链缺口、碱基转换和碱基脱落等各种问题^[4][5]，为古DNA的研究带来了巨大的挑战。

随着测序成本的下降和测序准确度的提高，对于古基因组的探索比之前有了空前的发展。从构建古人基因组，到构建类人动物、其它动植物，甚至真菌的基因组。不仅如此，还开展了群体基因组、宏基因组研究，甚至有些研究已经开始延伸到转录组和表观遗传领域了。

尽管已经取得了如此多的进展，但有1个关键限制因素始终存在——成本！虽然二代测序的成本已经以超过摩尔定律的速度在下降了，但是，由于大多数的古DNA是从复杂的富含外源DNA污染的环境中提取出来的。这些困难也就意味着——想要得到同样多的数据量，需要的测序深度要比现代DNA样本高得多。

近期华大基因联合丹麦哥本哈根大学、丹麦技术大学等开展了在BGISEQ-500和HiSeq 2500两个测序平台上进行古基因组的研究的比较，结果发表于2017年6月26日发表在GIGA Science上。

本研究中，分别采用BGISEQ-500和Illumina HiSeq 2500平台，对91-14000年前的8个古老大型犬科动物的DNA 样本进行测序（表1），并对测序性能和数据质量进行比较。研究结果表明，数据表现在两个测序平台上基本相当（表2）。BGISEQ-500是可用于古基因组测序的有效并有价值的潜在替代平台，值得用此平台进一步探索降解DNA。

表1： 8个历史古老的狗和狼样本信息

表2: 数据统计总结

* δD：双（Double）链损伤率，即双链胞嘧啶脱氢比率，（C->T）；

 δS：单（Single）链损伤率，即单链胞嘧啶脱氢比率，（C->T）；

 θ：考虑DNA损伤后参考序列和样本之间差异的背景率；

 Clonality：克隆率，在去DUP之后保留的reads数与去adapter和trim后的reads的比率；

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内源DNA水平

决定古基因组测序成本最大的因素就是内源核DNA的含量，以及内源核DNA平均序列长度。毫无疑问，这两个指标都是越高越好。而这两个对于测序成本最重要的指标在两个平台间并没有显著差异（表3）。而有意思的是，在距今14,000年前的三个样本（FRC、L、M1）中，竟然有一个（编号M1）的内源DNA含量与距今最近的样本含量相当。

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测序准确性

文章用双链和单链的胞嘧啶脱氢率（即C变成T）来计算DNA的损伤率。两个平台的双链DNA损伤率（δD）没有显著差异，但BGISEQ-500平台的单链DNA损伤率（δS）却略低。而与参考基因组差异的背景值θ，又是BGISEQ-500平台略高。

再进一步来看文库的复杂度。低复杂度的文库，会导致很多测序reads会来自相同的文库分子。从而导致当测序深度增加时，没有带来有效数据增加，反而是增加了更多的冗余数据或者是引入了偏向性。因此，测序时会更倾向于追求复杂度更高的文库。在本研究中，BGISEQ-500平台产生的8个文库中，竟然有7个的文库复杂度都显著的高于HiSeq平台（图1）。而其中差异最大的，正是距今14,000年前的最古老样本之一。如此看来，BGISEQ-500平台在古DNA的测序准确性上似乎略胜一筹。当然，这点还需要更多的研究，更多的数据来证明。

表3: 数据统计分析结果

* Significant at P<0.05 

图1 实线是在Illumina HiSeq 2500平台上文库复杂性的估计，

虚线是对BGISEQ-500平台测序的文库复杂性的估计，

8个样本中的每一个由不同的颜色表示。

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基因组覆盖均一性

为了讨论测序在基因组上的覆盖区域是否有平台的特异性，研究人员使用了k-mer频率和GC含量这两个参数。多数样品的两个平台测序方法之间的k-mer模式是一致的，样品配对聚集在一起。 只有2个样本（P83和1921）的差异略微明显（图2）。其中的样本1921，正是唯一一个BGISEQ-500比HiSeq 2500具有更低文库复杂性的文库，但具体其中的联系却很难解释。

图2  文库间k-mer计数的热图

研究发现平均GC含量没有统计学差异（表2，表3），进一步分析中，相同窗口的片段数在BGISEQ-500和Illumina之间有很好的相关性（图3，图4）。

图3  上图：每100Kb窗口的中值归一化片段数（normalised fragment count，NFC），

实线表示Illumina数据，虚线表示BGISEQ-500数据。 

下图：与上图相同的窗口中计算GC的百分比。

图4：100Kb的窗口的Illumina vs BGISEQ-500的中值归一化片段计数（NFC）。

每个点的颜色对应于窗口的GC含量。对于高质量样本（1921,214，FRC，M1），

可以观察到两个平台之间的NFC有非常好的相关性， 片段数似乎与GC含量相关。

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CNV

最后，文章还评估了CNV水平。虽然文库不均匀降解、片段化、克隆和数据低覆盖度使得CNV评估非常具有挑战性，但还是对两平台的CNV进行比较。 通过质控的相关系数r²值的范围为在0.35-0.96之间（表5）。结果说明了两种测序平台对于高质量CNV calls都是可行的，但很难说明CNV calls差异是由于测序平台上的还是文库性质的不同造成的。

表5：平台之间的相同基因组窗口中拷贝数的相关系数

a质量控制通过；b 质控结果良； c 至少有一个平台的质控失败

总结来说，虽然本研究仅基于8个标本，但无论其内源DNA含量（<1-75％）和标准化平均内源性DNA序列长度（约42-76bp）都是其他许多古代样品的典型值。研究结果除了错误率有非常细微的差异高之外，BGISEQ-500的性能在准确性、基因组覆盖均一性、CNV calling上都是可比的。值得一提的是，本次比较的对象HiSeq 2500平台，是目前公认的HiSeq系列平台中测序质量最高的平台。它的测序质量要显著高于目前使用更广泛的HiSeq 4000和Hiseq XTen。更何况，BGISEQ-500最低40元/G的价格，使得其在古基因组研究上更有优势。

★阅读原文请点击原文链接

这样看来，要玩转古基因组，BGISEQ-500是个不二选择！

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参考文献

1. Poinar HN (1999) DNA from fossils : The past and the future. Acta Paediatrica 88 :133-140.

2. Wandeler P, Smith S, Morin PA, Pettifor RA, Funk SM (2003) Patterns of nuclear DNA Degeneration over time-a case study in historic teeth samples. Mol Ecol 12:1087-1093.

3. Pääbo S, Higuchi RG, Wilson AC (1989) Aneient DNA and the polymerase chain reaction. The emerging field of molecular archaeology. J Biol Chem 264:9709-9712.

4. Greer S, Zamenhof S (1962) Studies on depurination of DNA by heat. J Mol Biol 4:123-141.

5. Poinar HN (2002) The genetic secrets some fossils hold. Acc Chem Res 35:676-684.

撰稿：蔡悦  郑小乐

编辑：市场部

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