测得了万年化石，又何惧陈年FFPE

从化石样本中获取的古DNA由于经历了长时间的水解、氧化作用及环境微生物降解作用等而严重破坏^[1]，其核DNA片段一般不超过150bp^[2]。而残存的片段内部还有许多单链缺口、碱基转换和碱基脱落等各种问题^[3][4]使得化石测序成为一大难题。

华大基因联合丹麦哥本哈根大学、丹麦技术大学等开展了一项在BGISEQ-500和市面上其他测序平台间进行14000年前的古基因组比较研究，结果表明BGISEQ-500具有更高的文库复杂度，在古DNA的测序准确性上略胜一筹^[5]。

FFPE（福尔马林固定石蜡包埋，Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded）样本虽然远不像化石样本那样经历过沧海桑田，但也存在类似古DNA研究的问题：

1. DNA质量差^[6][8]，测序Reads比对质量较低；

2. 福尔马林固定剂使得磷酸二酯键水解，导致不同程度的DNA断裂^[7]，文库片段偏小^[8]；

3. 比现代样本具有更高的duplicates，测序深度低且覆盖度低^[8]；

4. 福尔马林与任一链上的胞嘧啶核苷酸交联可导致腺嘌呤取代鸟嘌呤，导致人为引入C> T或G> A突变^[7][9]。

尽管如此，FFPE样本仍是目前医学领域和疾病诊断中的重要样本来源，能够为医学及药物研究提供精确和有效的病理信息。该类保存多年的疾病样本大多时候也无法进行重新采样，所以十分珍贵。华大BGISEQ平台测得了万年化石，又何惧陈年FFPE？快来看下FFPE在BGISEQ测序平台上的数据表现！

建库成功率高

从万例BGISEQ平台人全基因组重测序（WGS）测序数据中，随机统计了1,355个样本的下机数据，其中包含FFPE、血液、唾液等样本。常规基因组建库测序成功率为99%， FFPE样本建库测序成功率也在90%以上。

图1 BGISEQ WGS不同类型样品交付成功率

Duplicate比率低

为了便于评估，选用Horizon FFPE标准品GM24385样本对BGISEQ平台不同起始量200ng、500ng、1000ng及X测序平台起始量1000ng的样本平行测序，并进行重复。结果显示BGISEQ平台的duplicates仅为3%左右，而对于X测序平台来说，需要多测将近20%的数据量，来得到相同的有效测序深度（过滤、比对去重后）。

图2 主流二代测序平台上不同起始量的同一FFPE标准品duplicate比率

覆盖度高

在相同的有效测序深度下，BGISEQ平台不同起始量（200ng、500ng、1000ng）的10X以上覆盖率远远高于某测序平台的1000ng起始量的结果。

图3 主流二代测序平台上不同起始量的同一FFPE标准品覆盖度

覆盖均一性好

单碱基测序深度分布图和累积测序深度分布图显示，BGISEQ平台的FFPE样本测序深度均一性好，且不同梯度的起始量和重复均有较好的一致性。

图4 主流二代测序平台上不同起始量的同一FFPE标准品单碱基测序深度分布

单碱基测序深度分布图：可以从两点来看，第一、分布图符合正态分布；第二、峰越高越集中越好，峰值代表平均测序深度，越高越集中代表接近平均测序深度的碱基越多，测序均一性越好。 X轴表示测序深度，Y轴表示具有对应测序深度的目标区域的比例。

图5 主流二代测序平台上不同起始量的同一FFPE标准品累积测序深度分布

累计测序深度分布图：是单碱基测序深度分布的另一种展现形式，展示基因组上的覆盖率。X轴表示测序深度，Y轴表示达到对应测序深度及以上的基因组区域比例，峰下降的越平缓，代表基因组上覆盖的均一性越好。

变异精准度和敏感度高

FFPE标准品的SNP和InDel的精准度（Precision）和敏感度（Sensitivity）高，意味着BGISEQ平台检测发现变异的能力更强，并且结果中为真的突变的概率也高。

图6 主流二代测序平台上不同起始量的同一FFPE标准品SNP精准度和敏感度

图7 主流二代测序平台上不同起始量的同一FFPE标准品InDel精准度和敏感度

Sensitivity：灵敏度，又叫真阳性率（TPR），计算公式：灵敏度=真阳性/（真阳性+假阴性）。是指实际为阳性的样本中，判断为阳性的比例。例如，真正突变中，被判断为有突变的比例，它反映筛检发现变异的能力，灵敏度越高，假阴性越低。

Precision：精准度，也叫阳性预测值（PPV），计算公式：精准度=真阳性/（真阳性+假阳性），指筛检试验检出的全部阳性变异中，真正“变异”的例数（真阳性）所占的比例，反映筛检变异结果阳性中为真的突变的可能性，精准度越高，假阳性越低。

GC bias小

数据以100个碱基的大小为窗口，作GC含量分布图，结果越接近中间1.0的横线，表明覆盖深度越均一，GC bias越小。从下图5可以看到，BGISEQ平台的GC含量偏向性较小。

图8 8个FFPE测试样品GC含量分布图

*上述分析结果由华大信息分析流程所得，本结果不代表交付指标，最终解释权归深圳华大基因股份有限公司所有

FFPE样本的质量情况跟样本的年限，降解程度息息相关，并且不同的样本的情况也是千差万别，如此变化莫测的珍贵样本，且测且珍惜，华大BGISEQ测序平台给您不二的选择！

参考文献

1. Wandeler P, Smith S, Morin PA, Pettifor RA, Funk SM (2003) Patterns of nuclear DNA Degeneration over time-a case study in historic teeth samples. Mol Ecol 12:1087-1093.

2. Pääbo S, Higuchi RG, Wilson AC (1989) Aneient DNA and the polymerase chain reaction. The emerging field of molecular archaeology. J Biol Chem 264:9709-9712.

3. Greer S, Zamenhof S (1962) Studies on depurination of DNA by heat. J Mol Biol 4:123-141.

4. Poinar HN (2002) The genetic secrets some fossils hold. Acc Chem Res 35:676-684.

5. Mak S S T, Gopalakrishnan S, Carøe C, et al. Comparative performance of the BGISEQ-500 vs Illumina HiSeq2500 sequencing platforms for palaeogenomic sequencing[J]. GigaScience, 2017, 6(8):1.

6. Bonfiglio S, Vanni I, Rossella V, et al. Performance comparison of two commercial human whole-exome capture systems on formalin-fixed paraffin-embedded lung adenocarcinoma samples[J]. Bmc Cancer, 2016, 16(1):692.

7. Srinivasan M, Sedmak D, Jewell S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. The American journal of pathology. 2002;161:1961–1971.

8. Carrick D M, Mehaffey M G, Sachs M C, et al. Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue[J]. Plos One, 2015, 10(7):e0127353.

9. Williams C, Ponten F, Moberg C, Soderkvist P, Uhlen M, Ponten J, Sitbon G, Lundeberg J. A high frequency of sequence alterations is due to formalin fixation of archival specimens. The American journal of pathology. 1999;155:1467–1471. 

撰稿：郑小乐

编辑：市场部

猜你喜欢

近期热文

请继续关注“华大科技BGITech”公众号，

科技君将一如既往地为您提供精彩内容！

如有相关问题，欢迎后台留言~~

▼

关注华大科技，尽享精彩科研！