基因组也在玩“P图”？ 敢不敢做真实的自己！

“P过”的基因组，

到底好不好？

What？基因组也在玩“P图”？没错！在测序文库制备过程中，我们常通过聚合酶链式反应（PCR）来扩增随机的基因组片段，将微量的DNA大幅增加，以达到上机需求。然而，“P过”的基因组往往丧失了其真正的“颜值“，会带来某些不真实：

1、PCR常有一定的碱基错配发生。一般PCR错误频率为10^-6[1]～0.06%^[2]，碱基错配将降低DNA序列复制的保真性。

2、PCR扩增偏向性会导致覆盖均一性差^[3]。对于核酸模板而言，有的二级结构复杂，有的则热稳定性不好，这些因素都会影响PCR扩增效率。因此，并非所有基因组序列都能在PCR扩增文库中同等体现，而是存在明显的偏向性。

研究人员对由恶性疟原虫（基因组大小23Mb; GC含量19％），大肠杆菌（4.6Mb; GC含量51%）和球形红细菌（4.6Mb; GC含量69%）制备的等摩尔DNA混合物进行分析，GC含量的散点图基本上是从6％到90％GC平坦（图1a）。剪切DNA不会导致明显的偏斜（图1b），接头连接也不会导致明显偏移（图1c），从植被琼脂糖凝胶中切除较窄的片段也并未使基因组发生偏斜（图1d），然而，PCR循环后，GC出现偏向性（图1e）^[3]。

图1 I平台建库过程中GC偏向性变化^[3]

3、PCR扩增引入了大量易出错的InDel^[4]。InDel在基因组中分布广泛、密度大、数目众多，就分布密度而言, 仅次于SNP。在人类基因组中, 平均密度为每7.2Kb包含一个InDel，所有序列多态性中有16％至25％是插入缺失^[5]。InDel是一种常见的遗传变异形式，已被证明可导致或促成人类遗传疾病和癌症^[6]，例如孟德尔疾病^[7]、急性早期白血病^[8]、肺癌^[9]、肌肉萎缩症^[10]等。

当DNA两条链上的嘌呤嘧啶含量不平衡时会增加缺失发生的几率^[11]，序列中PolyA结构、 高GC含量的序列会增加复制滑移的几率, 而复制滑移会导致序列发生插入/缺失突变^[12]，而在这些区域中，PCR扩增会导致明显偏向性，引入大量易出错的InDel。PCR WGS 的InDel中，12%（380/3222）为低质量InDel，高质量InDel占比75%，而对于PCR-free WGS，低质量InDel仅为3%（86/2994），高质量InDel可达86%，这表明PCR-free文库构建可能是提高InDels准确性的一种可能的解决方案^[4]。

图2 高质量、中等质量和低质量InDel在

不同建库方法的分布^[4]

BGISEQ PCR-free WGS

是从建库到测序真正的PCR-free！

BGISEQ PCR-free WGS（人全基因组重测序）在文库构建过程中未进行PCR（聚合酶链式反应）扩增，从而避免了PCR错误和扩增偏向性的产生。且BGISEQ测序仪利用独特的DNA纳米球（DNB）技术，基于滚环复制（RCR）进行文库扩增，这种线性扩增可以避免常规PCR带来的错误累积，PCR-free建库 + DNB （DNA纳米球）核心测序技术，实现全方位PCR-free，为您还原最真实的全基因组序列。

图3 BGISEQ PCR WGS（a）和

BGISEQ PCR-free WGS（b）建库流程

快来感受“无P图”基因组的真正的“颜值”

○ 避免PCR错误

最大程度还原基因组原始序列信息；

○ 降低PCR扩增偏向性

出色覆盖高GC/AT含量区域、启动子和重复序列等PCR建库方法无法覆盖的区域^[13]；对低GC区域的覆盖度相比PCR建库提高了63%^[14]。

表1 PCR和PCR-free覆盖偏向性比较^[14]

标准品NA12878测序结果显示，BGISEQ PCR-free相对于不同测序平台、不同建库方法，GC均一性表现最佳。

图4 各平台PCR-free和PCR GC均一性比较

（以100个碱基的大小为窗口，绘制GC含量分布图，结果越接近中间1.0标注线，表明覆盖深度越均一）

○ 提高InDel检测的精准度和敏感度

在不同平台上，PCR-free WGS InDel精准度和敏感度可高达99%和95%，均比PCR WGS 高出5个百分点，PCR-free建库方法可明显提高InDel calling的准确性。

图5 各平台PCR-free和PCR变异精准度和敏感度比较

○ 无Index hopping担忧

对基于ExAmp（排他性扩增）的测序平台，容易发生index错误分配（index hopping）问题^[15]。同时，由于PCR-free的文库起始量高，需要加入更多浓度的index，因此更容易发生index hopping问题，index hopping比例甚至可高达6%^[16]。

图6 ExAmp平台PCR-free和PCR index hopping比例^[15]

最近的研究表明，基于DNB技术的BGISEQ平台，即便是PCR-free文库，也可以在很大程度上将index污染最小化，与常规PCR文库类似，污染率平均约为0.0004%^[17]。

表2 PCR-free 文库index污染比率^[17]

【欲了解更多相关信息请点击☞ 样本总是“戴错帽子”？解读错配率趋于0的DNA纳米球技术  】

○ Duplicates低，可用数据量大

BGISEQ duplicate rate非常低（1.22%-1.95%），非BGISEQ平台即便是PCR-free建库，duplicates仍然较高（10%左右）。

图7 各平台PCR和PCR-free duplicate rate比较

【欲了解更多相关信息请点击☞ Duplicates | NGS帝国的Agent Smith】

BGISEQ PCR-free WGS，可降低PCR扩增偏向性，减少GC-bias，从而更全面的检测体细胞突变^[18][19]，因此也更适合肿瘤基因组的研究，助力精准医学。

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【参考文献】：

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[17] Li Q, Zhao X, Zhang W, et al. Reliable Multiplex Sequencing with Rare Index Mis-Assignment on DNB-Based NGS Platform. bioRxiv, 2018: 343137.

[18] Nakagawa H, Wardell C P, Furuta M, et al. Cancer whole-genome sequencing: present and future[J]. Oncogene, 2015, 34(49):5943-50.

[19] Craig D W, Nasser S, Corbett R, et al. A somatic reference standard for cancer genome sequencing[J]. Scientific Reports, 2016, 6:24607.

撰稿：郑小乐

编辑：市场部

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