揭秘 | 6个RNA-seq就能发5分文章，精妙！

编者按

桑黄多糖治疗糖尿病效果显著，但其机制尚不清楚。研究者基于高糖高脂饮食的小鼠模型，在BGISEQ平台完成6个样本的转录组测序，通过层层深入的数据分析挖掘，构建出关键代谢通路及代谢网络，最终锁定一种肠道细菌，阐明了桑黄多糖增强胰岛素敏感性的机制。

文章标题：《Polysaccharides extracted from Phellinus linteus ameliorate high-fat high-fructose diet induced insulin resistance in mice》

期刊名称：《Carbohydrate Polymers》

研究单位：武汉轻工大学、香港大学

影响因子：5.158

发表时间：2018.11

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0144861718308798

发文奥秘

研究者基于转录组测序数据，应用基础GO、Pathway代谢通路富集分析，结合一些常见的生化实验，形成了严密的代谢关系网络，获得了充足确凿的证据，解释了桑黄多糖对糖尿病核心问题——胰岛素抵抗的药效作用机制。

文章至少分5个层次，结合转录组、表型数据，一路深挖。以下是数据分析挖掘思路概貌：

实验框架

研究者按以下样本处理方式获取3组小鼠肝脏样本，进行生化指标数据采集，其中HFD和PLP两组（每组3个重复样本）基于BGISEQ-500平台完成6个样本的RNA-seq测序。

分析转录组数据， 相比于HFD组，在PLP组中1110个基因表达量上调，221个基因表达量下调。通过KEGG代谢通路富集分析，发现差异表达基因主要富集在信号转导通路，而其中的FOXO通路、钙代谢通路等正好与研究者一直关注的性状相关（图1）。

图1 差异表达基因KEGG分析，富集通路包含FOXO通路、钙通路（图中红色方框）等

数据挖掘思路复盘

1.FOXO通路

研究者首先聚焦差异表达基因富集分析捕获的FOXO通路。 FOXO蛋白作为胰岛素代谢通路上的重要分子，对调控机体血糖的平衡有重要作用。但该通路当中各基因上下调关系未知，研究者通过分析KEGG通路图，发现该通路上的关键基因总体上都是上调（图2），后续qPCR验证与测序结果一致（图3）。

图2 小鼠肝脏转录组测序，高脂高糖+桑黄多糖组，和高糖高脂组，FOXO通路当中的基因总体都上调

图3 qPCR验证实验与测序结果一致

2.钙信号通路

差异表达基因富集通路当中所包含的钙信号通路，是研究者的另一个关注点。肝脏细胞的钙平衡，受磷脂酰胆碱与磷脂酰乙醇胺的比例（PC/PE）调控。那PC/PE比例表型是否有差异？研究者发现，PC/PE比例在高糖高脂组降低，服用桑黄多糖后恢复（图4）。

图4 高糖高脂饮食降低了PC/PE 比例，而桑黄多糖能使比例恢复正常水平

3.PC/PE比例的调控机制分析

PC/PE比例受什么机制调控？这里涉及两个重要分子：SAM和PEMT。SAM是甲基供体，在N-甲基转移酶PEMT催化作用下，PE可以转化为PC。

研究者首先分析了PEMT相关基因表达。qPCR实验显示，Pemt（表达PEMT的基因）在高糖高脂组中表达量高于常规饮食组，服用桑黄多糖后，Pemt表达量下降。

接下来研究者分析了SAM基因表达量变化情况。回归转录组数据，发现有两个差异表达基因参与SAM合成：Mat1a和Mat2b。高糖高脂+桑黄多糖组Mat1a表达量上调，但Mat2b表达量下调。SAM的浓度在组间没有显著差异，但其反式甲基反应副产物s-腺苷高半胱氨酸（SAH）在高糖高脂组升高，在桑黄多糖组恢复，从SAM/SAH比例看，高糖高脂组比常规组低，桑黄多糖服用组与常规组持平。SAH经代谢转化为高半胱氨酸（HCY），但HCY在三组间并无显著差异（图5）（HCY没差别，还可以如何挖掘？下文见分晓）。

图5 SAH在高糖高脂组升高，服用桑黄多糖后恢复，从SAM/SAH比率看，高糖高脂组比常规组低，在桑黄多糖组与常规组持平。HCY在三组间并无显著差异。

4..桑黄多糖对VB12的影响机制

进一步挖掘转录组测序数据，研究者发现桑黄多糖摄入改变了3个参与维生素B12运输和代谢相关基因的表达（从KEGG和GO代谢路径分析可得）；再来查看维生素B12的表型数据，发现高糖高脂组血浆维生素B12水平相比于常规组显著降低，服用桑黄多糖后改善（图6）。

图6 高糖高脂组血浆维生素B12水平相比于常规组显著降低，服用桑黄多糖后改善

5.桑黄多糖对肠道菌群的影响机制 

维生素B12参与HCY合成甲硫氨酸（前文提到HCY在实验样本组间无显著差异）的代谢路径，是甲硫氨酸合成催化酶的辅因子。与甲硫氨酸合成相关的基因表达量有无变化？回归转录组数据，研究者发现桑黄多糖处理提高了甲硫氨酸合成还原酶基因（Mtrr）表达，MTRR能恢复甲硫氨酸合成酶活性，促进氧化态维生素B12还原再生。

动物自身不能合成维生素B12，但肠道菌群可以。为了弄清桑黄多糖是否通过改变肠道菌群来影响维生素B12代谢，研究者采用PCR-DGGE实验，在高糖高脂饮食+桑黄多糖服用组，发现了一个特别的细菌——卟啉单胞菌丰度的改变。

这个菌是不是真的影响了维生素B12水平？钴啉酸a,c-二酰胺合酶（cbiA）是参与维生素B12合成的一个关键酶，检测编码该酶的 DNA在肠道菌群中的相对水平，发现服用桑黄多糖后，该DNA含量更高，这促进了维生素B12血浆浓度的恢复（图7）。

图7 服用桑黄多糖显著提升编码cbiA的DNA相对水平

6.分析结论

致此，两条代谢通路分析结果交汇到了一起，研究者据此推断，桑黄多糖的摄入影响了肠道菌群构成，特异性地促进了肠道细菌——卟啉单胞菌的增殖，促进了维生素B12合成，进而调节肝脏的甲硫氨酸代谢，使得磷脂酰胆碱与磷脂酰乙醇胺的比例恢复平衡。

文章总结

研究者通过层层深入地对转录组测序数据进行分析，挖掘出关键代谢通路和相关的其他基因及代谢产物，逻辑严谨，分析过程让人忍不住大呼畅快过瘾！尽管样本量少，作图朴素，也掩盖不住其中的科学思维光芒。

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撰稿：赵   青

编辑：市场部

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