赞！BGISEQ助力这类癌症病理治疗靶标的探索 | 文献解读

文章速览

肺癌是发病率和死亡率均列第一位的癌症，我国每年新增肺癌患者约78.1万，死亡病例约62.6万^[1]。肺腺癌和肺鳞癌（LUSC）是肺癌的主要病理类型，目前已经有多种靶向药物应用于肺腺癌；而占原发性肺癌的40%～51%的肺鳞癌，治疗靶点尚没有突破性进展。

今年2月，北京大学肿瘤医院胸部肿瘤外科二病区杨跃主任与华大联合在《Cancer Letters》（IF：6.491）上发表题目为《Genomic sequencing and editing revealed the GRM8 signaling pathway as potential therapeutic targets of squamous cell lung cancer》的文章，通过外显子重测序（WES）、人全基因组重测序（WGS）、靶区域捕获测序（TS）和CRISPR-Cas9基因组编辑技术，利用鳞状细胞肺癌手术肿瘤和对应的源自患者的异种移植瘤（PDX）样本，探索和验证肺鳞癌的潜在治疗靶标。

文章亮点

• 多平台数据联合分析：WES测序 + BGISEQ平台WGS测序 + BGISEQ平台TS测序；
  

• LUSC PDX模型可广泛应用于潜在治疗目标和策略的验证；

• 使用CRISPR系统对PDX肿瘤细胞中的驱动基因进行功能验证。

设计方案

本研究中，首先选择了11组高质量LUSC手术肿瘤和匹配的PDX肿瘤组织样本进行WES和WGS分析。从WES中鉴定出300多个携带SNV的重要基因，从WGS数据中鉴定出143个至少两个病例携带CNV的重要基因。然后对这11组及另外70对肺鳞癌手术肿瘤和对照正常样品进行靶区域捕获测序（TS）来验证携带高频率SNV或CNV的56个基因。通过CRISPR-Cas9系统在PDX肿瘤细胞中评估具有相对高突变频率的9个候选基因的功能。

图1 选样及测序分析设计方案

主要结果

1. LUSC PDX模型忠实地反映了对应手术肿瘤样本的分子特征

为了探索手术肿瘤（T）和PDX肿瘤（P1和P3）样品中体细胞突变的一致性，计算T和P1（O1）之间或T和P3（O3）之间的重叠突变数，并与T样品的总突变数（O1 / T或O3 / T）进行比较。 O1 / T和O3 / T的值分别为0.91至0.99和0.71至0.98（图2A）。这些高比率表明手术肿瘤中的大多数体细胞突变保留在PDX肿瘤中。

通过公布的贝叶斯NMF算法，根据不同的碱基取代模式，从T和P样品的基因突变中提取了5个突变特征。并且这五个特征的计数和比例在大多数手术肿瘤和对应的PDX肿瘤样本中保持一致（图2B，上图和下图）。在五个突变特征中，与吸烟相关的特征（W3）是主要特征，并且在大多数肿瘤样品中观察到。

从肿瘤样品中鉴定出四种类型的非同义体细胞突变：非同义和无义SNV，剪接突变和InDel，在三种肿瘤样本比例相似（图2C）。校正后不同肿瘤样本的突变等位基因频率MAF几乎相似（图2D），所有结果均显示在我们的研究中建立的LUSC PDX模型忠实地反映了相应手术肿瘤样本的分子特征。

图2 图A：T和P1（O1）之间或T和P3（O3）之间的重叠突变数；图B：五个突变特征的计数和比例；图C：非同义突变类型的比例；图D：等位基因频率（MAF）。

2. 发现9个肿瘤驱动候选基因

SNV和CNV的突变频率最高的30个基因中，筛选出7个基因，包括GRM1、PIK3CG、GRM8、FGFR2、PIK3CA、CSMD3和ZFHX4，以及仅含有CNV的两个基因，包括CLDN1和RIT1。在这9个候选基因中， GRM1、PIK3CG、FGFR2和PIK3CA据报道可促进多种恶性肿瘤的进展，但有必要验证它们在LUSC发展中的特定功能。其他5种基因GRM8、CSMD3、ZFHX4、CLDN1和RIT1在恶性肿瘤进展中的功能报道较少，需要进一步验证。

图3 SNV频率较高的top30基因

图4 CNV频率较高的top30基因

3. 7个基因可能促进LUSC癌细胞生存，2个基因则可能抑制LUSC的进展

细胞生存（Celltiter）和细胞毒性（LDH）测定的结果均显示GRM8、FGFR2、PIK3CG、GRM1、PIK3CA、CLDN1和RIT1的敲除都能够显著抑制相应PDX肿瘤细胞的存活并诱导其死亡。相反，ZFHX4和CSMD3的失活显著促进PDX肿瘤细胞的存活并抑制其死亡（图5B）。因此，GRM8、FGFR2、PIK3CG、GRM1、PIK3CA、CLDN1和RIT1可能起到促进鳞状细胞肺癌细胞生存的作用。ZFHX4和CSMD3可能在鳞状细胞肺癌中发挥肿瘤抑制作用。此外，GRM8基因变异在LUSC进展中的作用很少被报道，需要进一步验证。

图5 目标基因的功能验证

图A：靶向9个候选基因的sgRNA可以全部有效地诱导靶基因序列的切割；图B：细胞活力测定结果。表达SaCas9和靶向特定基因sgRNA的慢病毒感染PDX细胞，非靶向载体（NT）包装的慢病毒作为对照（t检验，*** p <0.001）。

4. GRM8的转录激活通过抑制cAMP途径和激活MAPK途径促进LUSC细胞的增殖

GRM8是谷氨酸家族G蛋白偶联受体的八个成员之一。它可以耦合到各种细胞内第二信使系统，以调节神经元功能，例如神经元兴奋性和发育。据报道，GRM8通过抑制腺苷酸环化酶活性来介导细胞内cAMP浓度的降低。

为了进一步研究GRM8在LUSC细胞中的功能，通过SAM CRISPRa系统在LUSC细胞系EBC-1和SK-MES-1中转录激活GRM8。根据CCK8测定和细胞计数的结果，与非靶向对照相比，GRM8活化显著增强EBC-1细胞的增殖（图6A）。通过ELISA测定cAMP测量和PKA的底物磷酸化测定揭示GRM8活化显著降低细胞内cAMP浓度和PKA活性（图6B和C）。

根据之前的研究，MAPK通路是传递增殖和存活信号的主要细胞内途径。cAMP通路的激活会阻断MAPK通路的激活。 与以往报道一致，图6D 的结果显示MAPK途径的关键组分MEK和ERK的磷酸化水平在GRM8活化后显著增强，表明GRM8激活抑制cAMP通路，从而激活MAPK通路。此外，cAMP通路激活剂Forskolin或MAPK通路抑制剂Selumetinib的处理可显著抑制由GRM8活化诱导的ERK的磷酸化上调（图6E和F）。CCK8和LDH测定的结果均显示Forskolin和Selumetinib的处理可显著抑制GRM8增强的EBC-1细胞增殖（图6G和H）。总之，GRM8的转录激活通过抑制cAMP途径和激活MAPK途径促进LUSC肿瘤细胞的增殖和存活。

图6 GRM8转录激活促进LUSC细胞增殖

图A：显著促进细胞的生长；图B：降低了胞内cAMP水平;图C：抑制细胞中PKA的活性；图D：上调MEK和ERK的磷酸化。图E/F: 经过cAMP激活剂和MAPK抑制剂处理，抑制ERK的磷酸化；图G/H：cAMP激活剂和MAPK抑制剂可抑制GRM8诱导的细胞增殖。

5. 点突变（SNV）（A112G）活化GRM8并诱导细胞增殖

GRM8在本研究的LUSC队列中具有16％的SNV频率，在TCGA LUSC群组中具有7.34％的SNV频率。在293T和LUSC细胞系中构建了A112G突变，根据细胞增殖测定，与野生型对照相比，A112G强烈诱导293T细胞和LUSC细胞的增殖（图7B和E）。A112G显著抑制PKA活性并上调293T细胞和两种LUSC细胞系中MEK和ERK的磷酸化，表明该突变赋予GRM8活化（图7C，D，F和G）。因此，A112G突变可能导致GRM8的活化，并在LUSC进展中起促进作用。

图7 GRM8的A112G点突变诱导细胞增殖

图A：Sanger测序显示点突变的位置(A112G)；图B/E：A112G突变显著促进293T和EBC-1细胞的增殖；图C/F：A112G突变抑制PKA的活性；图D/G图：突变上调MEK和ERK的磷酸化。

6. cAMP活化剂和MEK抑制剂可作为LUSC肿瘤的潜在治疗策略

Forskolin或Selumetinib治疗可以抑制LUSC-019的PDX肿瘤细胞的存活，Forskolin的抑制作用是剂量依赖性的，并且比Selumetinib更显著。Forskolin和Selumetinib的联合治疗显示出更显著的肿瘤细胞抑制作用（图8A）。所有数据表明GRM8激活变体包括拷贝数扩增和A112G突变通过抑制cAMP / PKA通路和刺激MAPK通路促进肺鳞癌细胞增殖（图8B）。cAMP激活剂和MEK抑制剂可能成为携带GRM8活化突变的LUSC肿瘤的潜在治疗策略。

图8 cAMP激活剂和MEK抑制剂作为治疗策略

图A：Forskolin和Selumetinib的联合治疗对PDX肿瘤细胞活力具有抑制作用；图B：GRM8活化通过抑制cAMP通路和激活MAPK通路促进LUSC细胞的增殖

通过基因组测序和CRISPR-Cas9基因组编辑的综合分析，在手术和PDX肿瘤上整合鉴定并验证了GRM8对LUSC肿瘤的促进功能。cAMP活化剂和MEK抑制剂可显著阻断具有GRM8突变的LUSC肿瘤细胞的增殖和存活。因此，GRM8信号传导通路的组成分子可能成为携带GRM8激活突变的鳞状细胞肺癌的治疗靶标。

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参考文献：

【1】Cancer statistics in China, 2015.

【2】Nakagawa H, Wardell C P, Furuta M, et al. Cancer whole-genome sequencing: present and future[J]. Oncogene, 2015, 34(49):5943-50.

【3】Craig D W, Nasser S, Corbett R, et al. A somatic reference standard for cancer genome sequencing[J]. Scientific Reports, 2016, 6:24607.

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撰稿：郑小乐

编辑：市场部

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