同1个cell，5倍有效数据！华大5X全长转录组如何实现的？

 

PacBio的Sequel测序平台测转录组，因其长读长优势，可以直接得到全长转录本信息，已被越来越多地用于构建/完善参考物种基因集。尤其是近年来，随着sequel测序芯片和试剂的升级，测序产量和读长得到了很大的提升，单G测序成本也大幅下降。大家开始对全长转录组的应用前景充满预期。

图1 UHRR（Universal Human Reference RNA，通用人参考RNA）基因饱和度分析。左边是全长转录组测序对应的reads数，1，2，3分别代表1个cell，2个cell，3个cell。以现有sequel测序的通量，1个cell测序（约20W reads）仅能检测到约62%的基因，随着测序数据量的提升，检测到的基因数目可以提升，相应的测序成本也会大幅提高。

然而，现实却远没有想象那么简单。对于全长转录组产品，以下这些误区还是要细细甄别！

1. 数据量增加=转录本数目增加？

相对sequel试剂升级带来的数据量增加，其带来的转录本数目增加几乎可以忽略不计。

虽然sequel试剂在不断升级，每个SMART Cell上的数据产出在不断提升。然而，该数据产量增加主要是通过读长增加做到的。也就是说，测的越来越长（如表1所示，从2.0芯片到3.0 LR芯片，测序长度提升了5倍），得到的数据量越来越高了（从2.0芯片到3.0 LR芯片，数据量提升了8倍），转录本数量却未必增加了多少！

表1. Sequel平台不同版本试剂数据表现

2. 测序长度越长=得到转录本越长？

目前的测序长度几乎可以覆盖所有的转录本长度，继续增加读长，得到更长转录本的概率极低。

也许有人会说，测得长也挺好啊，我需要的就是全长转录本啊。那么，是不是测得越长得到的全长转录本数目越多呢？事实上，绝大部分的转录本长度都在2Kb以下，在sequel 2.1芯片测序平均读长23K的情况下，就可以覆盖到几乎所有的转录本；sequel3.1 LR芯片测序读长可达80K，得到更长转录本概率极低。如何让多出来的读长发挥更大的价值，可能是我们需要考虑的问题。

图2 转录本长度分布图。

左，UHRR转录本长度分度；右，玉米转录本长度分布。

3. 测序长度越长，序列准确度越高？

测序长度越长，序列准确度越高，但增加测序长度不是提高序列准确度的唯一方法，且该方法性价比不高。

Sequel测序中构建哑铃型文库，在插入片段比酶读长短的情况下，通过环形比对测序（Circular Consensus Sequencing, CCS），同一个片段可以被循环测到很多次，这在很大程度增加最终得到的序列准确性。目前2.1试剂测序得到的CCS序列准确度在0.93左右，随着测序长度不断增加，CCS序列准确度会得到进一步提升。

图3 CCS测序示意图。

在sequel数据分析中，为了提高最终得到的转录本序列的准确度，得到CCS序列之后会进行reads聚类和isoform校正，进一步提高isoform准确度，同一isoform测到的条数越多，校正后的准确度越高。这一步可以通过阈值设定，筛选准确度达到要求的用于后续分析，目前一般将isoform校正后准确度在0.99以上判定为高质量isoform。

所以，随着sequel测序读长的增加，得到isoform准确度会增加；同时我们还可以通过isoform校正来提高isoform准确度，同一isoform测到的条数越多，校正后的准确度越高。相对来说，提高测序reads数既能提高isoform准确度又能增加基因/isoform检出量，性价比更高。

图4 Isoform校正过程示意图。

综上所述，目前sequel试剂升级带来了数据产量和测序读长的大幅提升，但并不能提高最终检测到的转录本数目和长度，在提高测序准确度方面性价比也不高，很大程度上浪费的sequel的数据量和读长。

那么如何让sequel试剂升级发挥更大的价值呢？

为什么不试试5X全长转录组？！

为了充分利用sequel测序越来越多的数据，华大基因Dr.Tom主导研发5X全长转录组产品，在建库过程中将多个转录本首尾相连构建sequel文库；通过CCS测序，一条CCS read可得到多条转录本，大幅提升sequel测序全长reads的获得率。

图5 5X全长转录组建库示意图

5X全长转录组可将单个Sequel cell测序得到的全长reads数提升5倍；检测到的基因和转录本数目都有明显提升，并结合UMI可实现准确的基因或转录本定量。

1）全长reads数提升可达7倍以上

同样的测序数据量，5X全长转录组产品测序一个cell检测到的reads数是常规sequel检测方法的3-5倍，最高可达7倍以上。

图6 Reads数统计。排除原始数据产量的影响，5X全长转录组测序得到的全长reads数可高达常规文库的7倍以上。

2）转录本检测数目可提升1倍以上

5X全长转录组产品1个sequel cell检测到的基因和转录本数目远高于常规文库，转录本数目检测数目可提升1倍以上。

图7 转录本检测数目。

5X全长转录组产品测序1个cell检测到转录本数目可提升1倍以上。

3）序列准确度高

5X全长转录组产品下，同一序列CCS测序得到的full-pass数会减少，但isoform校正过程中可用的reads数会相应增加，最终得到的序列准确度并不会降低。如下表所示，同样数据量情况下，普通文库CCS测序full-pass数是5X全长转录组产品的3.1倍，而5X全长转录组产品在isoform校正过程中的平均reads数是常规文库的2.9倍左右。

表2. 5X全长转录组文库和常规文库测序平均pass数比较

表3. 5X全长转录组文库和常规文库测序每条转录本平均reads数比较

4）基因定量结果更准确

5X全长转录组产品将UMI（Unique molecular identifier，特异性分子标识符）和数据量提升完美结合，全长转录组也可以做基因定量了！如下图所示，5X全长转录组基因定量结果和短读长测序（PE测序）定量结果一致性好，后者是目前普遍认可的基因定量方法。而常规全长转录组测序和PE测序的一致性极差，完全不能用来定量。

图8 基因定量一致性。左，spearman系数；右，pearson系数。

5）测1个sequel cell就可满足需求

有了5X全长转录组产品，对于转录本复杂度不是太高的物种，一般测1个cell数据就可满足研究需求，再也不用在数据量和测序成本间做取舍了！以下是科技君整理的已发表物种全长转录组测序数据量，选择转录本复杂程度相近的物种作参考效果更佳哦：

更多5X全长转录组产品信息，请访问华大科技官网或咨询华大基因当地科技代表。

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撰稿：张   义

编辑：市场部

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