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哎呀,外显子测序的这些坑,千万不能再踩了 | 端午节大促

inm 华大科技BGITech 2019-12-12


外显子测序(WES)高效、精准、省力、好用,是肿瘤研究、临床检测等方向的有力应用工具。大家关心的指标大都是采用的富集技术或建库方案、捕获区域的大小和效率、测序质量、覆盖度等。


但是,只要这几个指标参数漂亮,就行了吗?不!下面这些坑,记得绕开!


另外,直接拉到文末可了端午节大促详情,还有最新的方案手册抱回家!


01

覆盖度数据很漂亮,但……

有的产品为了让参数好看,故意跳过捕获效率低、难设计探针的区域,好看的数据背后是真正有意义的靶标面临丢失的风险。

 

推荐:Agilent SureSelect Human All Exon V6人全外显子捕获系统。


理由:基于液相探针杂交捕获技术的Agilent平台最常用,其采用120-mer的RNA作为“诱饵”探针,优化的设计确保了出色的数据库覆盖率,能够高效地捕获带有SNV、InDel等突变的基因组序列。目前,该技术广泛应用于癌症等复杂疾病相关的遗传变异研究中,并获得了国际癌症协会(ICGC)的鉴定认可。对于低频突变的项目,覆盖度的均一性要求更高,华大内部大量数据累计发现均一性在95%左右,且数据表现很稳定。


02

捕获效率可以达到80-90%?

捕获效率指比对到靶向区域的数据的占比。有些产品为追求数据好看,跳过高GC、高重复区域,比如基因的第一个外显子区域。另外有些服务机构的捕获效率是基于Read统计。

 

推荐:对选定的基因查看demo数据的详细捕获和覆盖表现。统一按照base的统计方法比较捕获效率。


理由:基因的捕获完整度才是后续分析的基础。基于Read统计的有效深度其实是虚高的,真实的深度会更低,真实覆盖度表现也会受影响。



注意了!以下这些坑不仅WES会遇到,其他产品也很难避免!


03

一味追求测序质量值?

各测序技术的技术原理、信号检测方法不同,对应的物理参数、化学反应参数、质量模型也不同。Q30是高质量碱基的比例,并不代表数据集质量的高低。

 

推荐:评价测序仪给出的错误率的准确性,宜用这两种种方法:Mismatch和碱基质量校正(BQSR)


理由:在允许1个错配的情况下,基因组上有92%以上的区域可以被Reads唯一比对上。换言之,可以认为比对结果是高度可信的。这时mismatch的高低可反映出真实的错误率。人类基因组的SNP频率约为千分之一,从mismatch中剔除已知的变异(如dbsnp),则剩下的可认为全部为测序错误,可统计得到原来的Q值所对应的真实错误率,从而对Q值进行校正。


04

排他性扩增可以增产?小心index hopping!


为提高测序芯片的有效数据,I平台采用排他性扩增,但这样容易导致index hopping问题,每个样本中可能有5%-7%的数据属于其他样本。总体来说,该问题对低频突变检测结果影响更大。

 

推荐:使用基于DNBSEQTM技术的BGISEQ测序平台,其采用RCA(Rolling circle amplification)滚环扩增,序列扩增过程更保真。


理由:BGISEQ平台每个扩增循环都以原始的单链环状DNA文库为模板,保持每个拷贝子的独立性。即使出现寡核苷酸的index hopping等错误,也不会累积错误拷贝,正确的序列总是会在后面的DNA拷贝中复制,保证最高的扩增保真度。仅使用单个index就实现了0.0001%至0.0004%低样本错误分配率。

不同测序技术的index hopping比例



05

价格越低越好?

测序服务投入的质控环节越多,成本相应越大,但如果质控做不好,受害的就是客户。这个时候质量就是硬道理,不要被表面的低价迷惑了。


推荐:找有口碑,团队稳定、认证齐全的服务商,将报价和服务体系、流程整合起来整体比较。


理由:有的服务商接头质控有问题,但依旧对外提供服务(indexA中混合了indexB和indexC,当分别把index A,B,C给a,b,c样品带上标签后,测序完成后数据拆分时,b和c的样品中可能都会混合有a的样品)。接头的质控依赖实验团队严谨的质控体系,依赖为客户负责的责任心。在华大,每一个环节都有严格的质控体系,如果数据出现问题,内部会第一时间排查问题,选择重新建库或者加测数据,不合格的数据在分析时也会被过滤掉,或者标记出来。



对于WES,选择在华大质控体系下,执行Agilent v6建库捕获探针、BGISEQ测序,让人放心!


BGISEQ自主平台自推广以来,共推出9大产品,测序样品超过17万。其中WES产品已经完成5万个样品的测序分析。华大一直秉承认真的态度、完整的质控体系、优质的交付数据。截至发稿前,BGISEQ自主平台共发表393篇文章,累计影响因子已达到1818。因为信任和依赖,越来越多的客户选择BGISEQ测序平台。

BGISEQ自主平台部分已发表文章


而华大发表的WES文章中,约70%以上都是基于安捷伦的液相捕获探针。3月,《BMC Bioinformatics》上发表了一篇BGISEQ平台的WES产品评测文章。文章通过BGISEQ-500和HiSeq 4000测序平台,对标准品NA12878测序,使用瓶中基因组数据作为验证集,从多个角度对两个平台的数据进行了全面比较。结果说明,BGISEQ-500平台非常适合外显子测序研究。


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撰稿:inm

编辑:市场部


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