哎呀，外显子测序的这些坑，千万不能再踩了 | 端午节大促

外显子测序（WES）高效、精准、省力、好用，是肿瘤研究、临床检测等方向的有力应用工具。大家关心的指标大都是采用的富集技术或建库方案、捕获区域的大小和效率、测序质量、覆盖度等。

但是，只要这几个指标参数漂亮，就行了吗？不！下面这些坑，记得绕开！

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01

覆盖度数据很漂亮，但……

有的产品为了让参数好看，故意跳过捕获效率低、难设计探针的区域，好看的数据背后是真正有意义的靶标面临丢失的风险。

推荐：Agilent SureSelect Human All Exon V6人全外显子捕获系统。

理由：基于液相探针杂交捕获技术的Agilent平台最常用，其采用120-mer的RNA作为“诱饵”探针，优化的设计确保了出色的数据库覆盖率，能够高效地捕获带有SNV、InDel等突变的基因组序列。目前，该技术广泛应用于癌症等复杂疾病相关的遗传变异研究中，并获得了国际癌症协会（ICGC）的鉴定认可。对于低频突变的项目，覆盖度的均一性要求更高，华大内部大量数据累计发现均一性在95%左右，且数据表现很稳定。

02

捕获效率可以达到80-90%？

捕获效率指比对到靶向区域的数据的占比。有些产品为追求数据好看，跳过高GC、高重复区域，比如基因的第一个外显子区域。另外有些服务机构的捕获效率是基于Read统计。

推荐：对选定的基因查看demo数据的详细捕获和覆盖表现。统一按照base的统计方法比较捕获效率。

理由：基因的捕获完整度才是后续分析的基础。基于Read统计的有效深度其实是虚高的，真实的深度会更低，真实覆盖度表现也会受影响。

注意了！以下这些坑不仅WES会遇到，其他产品也很难避免！

03

一味追求测序质量值？

各测序技术的技术原理、信号检测方法不同，对应的物理参数、化学反应参数、质量模型也不同。Q30是高质量碱基的比例，并不代表数据集质量的高低。

推荐：评价测序仪给出的错误率的准确性，宜用这两种种方法：Mismatch和碱基质量校正（BQSR）。

理由：在允许1个错配的情况下，基因组上有92%以上的区域可以被Reads唯一比对上。换言之，可以认为比对结果是高度可信的。这时mismatch的高低可反映出真实的错误率。人类基因组的SNP频率约为千分之一，从mismatch中剔除已知的变异（如dbsnp），则剩下的可认为全部为测序错误，可统计得到原来的Q值所对应的真实错误率，从而对Q值进行校正。

04

排他性扩增可以增产？小心index hopping！

为提高测序芯片的有效数据，I平台采用排他性扩增，但这样容易导致index hopping问题，每个样本中可能有5%-7%的数据属于其他样本。总体来说，该问题对低频突变检测结果影响更大。

推荐：使用基于DNBSEQ^TM技术的BGISEQ测序平台，其采用RCA（Rolling circle amplification）滚环扩增，序列扩增过程更保真。

理由：BGISEQ平台每个扩增循环都以原始的单链环状DNA文库为模板，保持每个拷贝子的独立性。即使出现寡核苷酸的index hopping等错误，也不会累积错误拷贝，正确的序列总是会在后面的DNA拷贝中复制，保证最高的扩增保真度。仅使用单个index就实现了0.0001％至0.0004％低样本错误分配率。

不同测序技术的index hopping比例

05

价格越低越好？

测序服务投入的质控环节越多，成本相应越大，但如果质控做不好，受害的就是客户。这个时候质量就是硬道理，不要被表面的低价迷惑了。

推荐：找有口碑，团队稳定、认证齐全的服务商，将报价和服务体系、流程整合起来整体比较。

理由：有的服务商接头质控有问题，但依旧对外提供服务（indexA中混合了indexB和indexC，当分别把index A,B,C给a,b,c样品带上标签后，测序完成后数据拆分时，b和c的样品中可能都会混合有a的样品）。接头的质控依赖实验团队严谨的质控体系，依赖为客户负责的责任心。在华大，每一个环节都有严格的质控体系，如果数据出现问题，内部会第一时间排查问题，选择重新建库或者加测数据，不合格的数据在分析时也会被过滤掉，或者标记出来。

对于WES，选择在华大质控体系下，执行Agilent v6建库捕获探针、BGISEQ测序，让人放心！

BGISEQ自主平台自推广以来，共推出9大产品，测序样品超过17万。其中WES产品已经完成5万个样品的测序分析。华大一直秉承认真的态度、完整的质控体系、优质的交付数据。截至发稿前，BGISEQ自主平台共发表393篇文章，累计影响因子已达到1818。因为信任和依赖，越来越多的客户选择BGISEQ测序平台。

BGISEQ自主平台部分已发表文章

而华大发表的WES文章中，约70%以上都是基于安捷伦的液相捕获探针。3月，《BMC Bioinformatics》上发表了一篇BGISEQ平台的WES产品评测文章。文章通过BGISEQ-500和HiSeq 4000测序平台，对标准品NA12878测序，使用瓶中基因组数据作为验证集，从多个角度对两个平台的数据进行了全面比较。结果说明，BGISEQ-500平台非常适合外显子测序研究。

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撰稿：inm

编辑：市场部

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