血浆蛋白新视角——低丰度小蛋白！

李巧珍黄梦楠华大科技BGITech 2022-04-17

2019年7月15日，《Molecular & Cellular Proteomics 》杂志发表了澳大利亚科研团队的一项成果，研究人员开发了一种新的蛋白富集方法，实现了快速、无偏好定量检测低丰度、低分子量的人体血浆小蛋白。

人血浆中的小蛋白(如激素、免疫因子、代谢调节剂等) ，分子量小，丰度也相对较低，在维持机体稳态方面发挥着重要功能，其特异性定量检测在临床诊断中意义重大。然而，如何快速、无偏好地富集和检测这一类蛋白质一直是科研界的一大难题。

以往，我们会使用ELISA或其他特殊的富集方法结合靶向质谱定量技术对小蛋白因子进行检测。这些方法快速灵敏，但价格昂贵、通量低，一次只能检测一个蛋白，不能对血液成分进行全局检测，还会妨碍新生物标志物的发现。

该研究团队开发出的血浆小蛋白富集方法名为SPEA（small protein enrichment assay），能对人体血浆中的100多种低丰度小蛋白进行无偏好富集，再进行快速定量分析, 大大提高了检出效率，降低了成本，也为不同组织或不同条件下新生物标志物的发现提供了机会。

研究方法简述


1	研究团队首先分析了人体分泌蛋白的分子量与丰度值，发现丰度最高的前200种蛋白质，分子量大于15kDa；与临床诊断相关的小蛋白分子量则在2-10kDa之间，其功能分类主要是信号受体活性调节器（如激素）、免疫反应（如趋化因子、抗菌肽、补体级联）、蛋白水解负调节器和压力应对。
2	接下来，研究人员采用2-10kDa的SEC柱进行蛋白富集，去除分子量高于10 kDa的大蛋白和小于2 kDa的小降解产物，由此筛选出分子量在2-10 kDa的临床诊断相关蛋白。
3	研究团队采用分组DDA方法采集质谱数据，与收录有42,325蛋白序列的Uniprot数据库进行比对，鉴定出900多个蛋白质和6000多个肽段。
4	最终研究团队鉴定的已知小蛋白超过125种，还鉴定出一种新发现的人血浆蛋白——C5ORF46。应用SPEA方法与传统非富集方法鉴定到的蛋白丰度相似。

实验验证


1	为检验该方法对低丰度蛋白检测分析的可重复性，研究人员将稳定同位素标记的胰岛素加入人血浆进行实验验证，证实实验可重复性高。
2	为进一步说明新方法的实用性，研究人员采用2h DIA方法对间歇性禁食减肥临床试验组的个体进行血浆数据采集，鉴定出500多个蛋白，2000多个肽段，还意外观察到实验个体的其他的变化指标，如其血浆中的铁稳态调节因子——铁调素的含量降低。最后，研究团队采用ELISA技术对上述样本的铁调素指标进行验证，两种方法检测结果一致性良好。