天然彩色棉是如何形成的？华大多组学技术助力棉花品种改良！

天然彩色棉（Naturally Colored Cotton，NCC）一直是棉花育种研究中的热门话题。与白棉和化纤相比，NCC在纺织品加工过程中无需进行染色和漂白步骤，这大大减少了有毒污染物的排放，降低了生产成本，并对保护环境有着重大意义。

但是，目前NCC有棕色和绿色两种颜色表现不稳定的品种，同时据报道，NCC的纤维质量和产量与纤维颜色成负相关，NCC通常比白棉花产量更低。这些因素严重限制了NCC的大规模生产和应用，也造成NCC成本高昂。因此，为了同时提高NCC的颜色稳定性和纤维质量及产量，非常有必要对NCC纤维色素产生和沉积的分子机制进行研究，了解影响其纤维发育的机理，进行品种改良。

图1 棕色的天然彩色棉

近日，中国彩棉集团博士后工作站联合中国农业科学院棉花研究所和石河子大学研究团队，采用蛋白质组学和代谢组学对此机制进行了研究，发现了可能参与棕色NCC纤维褐色形成的两条代谢通路FB和SSM。相关文章于2020年11月发表在农林科学领域一区Top期刊Industrial Crops and Products上。

设计思路

白棉纤维的发育有四个阶段：纤维细胞分化、纤维伸长、次生壁增厚、脱水和成熟，这是一个复杂的过程，涉及多个基因的共表达和转录调控。NCC的发育通常也遵循这四个阶段，不同之处在于棉纤维发育过程中还会发生色素合成和沉积。

本研究分别对DPA（days post-anthesis）0天、10天、20天、30天的棕色NCC棉（Z161）及其近等基因系白色棉（RT）上胚珠/纤维样本进行形态学观察及蛋白组学和代谢组学分析，寻找纤维素形成以及色素沉积过程中的重要分子基础和相关代谢途径。

首先通过电镜进行形态学观察，发现棕色NCC（Z161）的色素合成发生在纤维发育过程中，且最终沉积在纤维细胞中腔中；白棉（RT）没有发生任何色素沉积。

之后对棕色NCC（Z161）和白棉（RT）两种棉花的0DPA、10DPA、20DPA、30DPA胚珠/纤维进行蛋白提取，每组各3例生物学重复，共24例样品进行iTRAQ蛋白组学分析（图2）。对来源相同的另外24例样品进行非靶向代谢组学检测，分析与纤维素发育和色素沉积相关的DAPs和代谢途径，最后使用MRM技术对iTRAQ结果进行验证。

图2 iTRAQ流程图

主要结果

1. 棕色NCC（Z161）和白棉（RT）表型特征比较分析

在生长早期阶段对棉花田间性状进行研究（图3, a），共检测棉铃重、皮棉百分比、种子指数、纤维长度（mm）、纤维长度均匀性、马克隆值、纤维强度（cN / tex）和纤维伸长率等八个性状，发现两种基因型棉花之间没有显著差异。因此，NCC（Z161）和RT的表型特征除了成熟的纤维颜色外基本相同（图3, b）。

图3 两种基因型棉花的形态学观察 a, 外观比较  b, 棉纤维颜色比较

2. 不同纤维发育阶段棉花的蛋白质组和代谢组研究概述

对iTRAQ结果进行分析后发现，两种基因型棉花间的DAPs（differentially abundant proteins）数在0 DPA时最低，20 DPA时最高，而单个基因型棉花两个相邻阶段间的比较显示，大多数DAPs发生在10/0 DPA（最高1900），20/10 DPA时DAPs最少而30/20 DPA时DAPs稍多（图4）。结合不同基因型间DAPs数据可以看出，20 DPA是最重要的纤维发育阶段，在此期间可能发生色素的合成和积累。

图4 两种基因型棉花在4个生长阶段中发生上下调的DAPs

为了比较NCC（Z161）和RT之间涉及纤维色素沉着的代谢物组成，使用非靶向代谢组学技术对样品进行了检测。正负离子模式下，代谢物数量变化趋势相似；比较组 10/0 DPA在NCC（Z161）中的下调DAMs（differentially accumulated metabolites）多于RT；同一时间NCC（Z161）和RT的代谢物在20DPA时上调DAMs最多；而下调DAMs在各个时间段较为相似（图5）。

图5 同一时期两种基因型间差异代谢物数量分布

3. 纤维发育过程中的蛋白质组和代谢组分析

对NCC（Z161）相邻发育阶段的DAPs进行KEGG富集分析，得到18条相关代谢通路。将这18条通路及非靶向代谢组正、负离子下DAMs参与的代谢通路进行交叉分析，发现14条共有代谢通路（图6）。对这14条KEGG通路中的87个DAPs进行深入分析，发现在Z161-10/0比较组上调、但在Z161-20/10 和Z161-30/20比较组下调的大多数DAPs，参与“黄酮类生物合成（FB）”和“抗坏血酸和阿尔达酸代谢”，表明NCC（Z161）中FB途径中的蛋白积累发生在纤维发育早期。

图6 维恩图显示了蛋白组和代谢组特有和共有的KEGG通路

4. 棕色NCC（Z161）和白棉（RT）间蛋白质组和代谢组分析

对相同发育阶段不同基因型间的DAPs、及正负离子模式下的DAMs进行KEGG富集分析并整合，共得到33条常见KEGG通路（图7）。其中两条通路最为重要，类黄酮生物合成通路 (FB) （83.87 %的蛋白质发生上调）和淀粉与蔗糖代谢通路 (SSM)（88.89 %的蛋白质发生下调）。推测这两种通路中丰度变化明显的蛋白质很可能参与NCC（Z161）色素合成。

图7 棕色NCC（Z161）和白棉（RT）DAPs和DAMs通路富集整合结果

5. FB和SSM参与棕色NCC（Z161）纤维褐色形成

进一步分析FB和SSM通路得到相关分子机制，棕色NCC纤维色素沉着的最终生物合成途径是在LAR和ANR的作用下生成原花青素（PA），之后在缩合酶和多酚氧化酶（PPO）的作用下形成缩合类单宁，而非传统花青素途径（图8）。

在SSM通路中，棕色NCC参与纤维素合成途径（CS）的蛋白水平比白棉低，这些蛋白可能参与了FB或其他通路。这些独特的蛋白质组和代谢组表达水平，很可能是影响棉花颜色的关键性因素。

图8 类黄酮生物合成FB通路图

6. 通过MRM验证iTRAQ分析结果

选取包括FB、SSM在内三条重要代谢通路的15个候选DAPs，使用MRM技术进行检测。结果显示其中10个DAPs与iTRAQ结果相似，且iTRAQ和MRM数据间存在正相关（图9）。MRM结果证实了iTRAQ蛋白质鉴定和定量结果的可靠性。

图9 MRM结果与iTRAQ结果呈现正相关

科技君点评

1. iTRAQ试剂共8个标签，适用于少于8例样品的检测。本案例蛋白质组学共测定24例样本，既可以选择iTRAQ标记蛋白定量技术，分3批次进行分析，也可以用到DIA蛋白定量技术。DIA蛋白定量技术是目前大规模样本蛋白质组检测的理想手段。

2. 本案例采用多组学结合的研究思路，结合蛋白质组学+代谢组学，对棉花中纤维发育及色素合成沉积过程进行分析。多组学能更全面深入进行机制相关研究，有助于组学数据的高深度挖掘。华大基因目前能提供各组学间的关联分析，实现多组学全贯穿！

3. 通过iTRAQ/IBT/TMT/DIA等获得差异蛋白，结合表型和研究目的进一步筛选得到重点关注的差异蛋白，选择MRM/PRM，或免疫法进行验证，完成从发现到验证全过程。华大基因可提供iTRAQ/IBT/TMT + MRM/PRM、DIA + MRM/PRM的一站式服务，满足科研工作者各方面需求！

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原文链接:

https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0926669020309626

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