项目文章 | 单细胞转录组+单细胞蛋白质组联合发力，为探索糖尿病治疗提供新思路！

胰岛具有复杂的异质性和亚种群，包含异质性细胞、未成熟和成熟的亚群。由于胰岛素是血糖的主要调节器，大多数关于胰岛功能障碍的研究都局限于β细胞。然而，越来越多的证据强调了α、β和δ细胞在葡萄糖稳态中的协同相互作用^[1-3]。高脂肪饮食（HFD）是导致2型糖尿病的一种常见原因，它会导致胰岛的代偿性适应，随着胰岛功能损伤加剧，会使得病人的症状加重^[4-6]。目前迫切需要α、β和δ细胞亚群的细胞表面标志物，以探索肥胖进展和糖尿病发病过程中各亚群的组成变化，以及高脂饮食诱导胰岛代谢的适应机制。

南京医科大学第一附属医院内分泌科杨涛教授团队在Diabetologia（IF=10.12）上发表了题为“Single-cell RNA sequencing combined with single-cell proteomics identifies the metabolic adaptation of islet cell subpopulations to high-fat diet in mice”的文章（点击文末“阅读原文”查看文献）。

该研究采用单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合单细胞蛋白质组学分析，深入阐明了各α、β、δ细胞亚群在葡萄糖耐受不良中的功能状态，为探索胰岛内分泌亚群在健康和疾病中的命运和功能机制提供了基础资源。

南京医科大学第一附属医院付麒、蒋和敏、钱玙为本文共同第一作者，杨涛、徐宽枫研究员为共同通讯作者，华大科技质谱平台为该研究提供了单细胞蛋白质组学分析服务。

研究思路及主要成果

图1 研究流程图

1、小鼠胰岛细胞scRNA-seq

该研究将4周大的雄性小鼠随机分成两组，正常喂养（CD）组和高脂肪饮食（HFD）组，喂养8周，每周监测体重。8周的HFD诱导小鼠明显肥胖，葡萄糖稳态受损，并诱导胰岛素抵抗，HFD导致胰岛团块代偿性增生，尤其是β细胞。研究人员利用高通量scRNA-seq分析了15,093个来自CD小鼠胰岛的细胞和18,906个来自HFD喂养小鼠胰岛的细胞，并聚成四种主要内分泌细胞，基于主要激素基因表达进行了注释：4,069个α（Gcg）、14,108个β（Ins1）、1,698个δ（Sst）和666个PP（Ppy）细胞。

从HFD组与CD组比较的α、β、δ细胞的差异表达基因（DEGs）来看，α、β、δ细胞内质网蛋白加工明显富集，炎症相关通路在α细胞中特别丰富（图2a），这表明炎症反应对HFD诱导的代谢应激的重要性。在β细胞中，钙转运和离子通道调节途径排在首位（图2b），表明其与分泌功能相关。此外，在β和δ细胞中，氧化呼吸链、能量产生和代谢途径都显著富集。在δ细胞中，其他显著受HFD影响的途径是蛋白质降解和循环相关途径（图2c）。

图2 HFD和正常组之间α（a）、β（b）和δ（c）细胞中DEGs富集的KEGG通路前20位

2、胰岛细胞亚群的单细胞蛋白质组学分析

由于mRNA的表达不能完全反映细胞或器官的生物活性，全面的蛋白表达谱在胰岛细胞亚群研究中是必不可少的。然而，传统的蛋白质组学需要样本量高，而小鼠胰腺中胰岛细胞数量有限，流式细胞仪分类的细胞亚群产量低。

因此，该研究对胰岛细胞亚群进行了单细胞蛋白质组学分析。首先，研究人员利用大量胰岛样品的谱库，在数据依赖采集模式下进行质谱（MS）数据采集，鉴定出90,494个多肽和8,168个蛋白质。接下来，MaxQuant集成的Andromeda引擎识别了α、β和δ亚群的单细胞蛋白质组学样本中的蛋白质。最终，在36个胰岛细胞亚群样本（2种饲料×3种内分泌细胞类型×2种细胞亚群×3个重复）中，研究人员鉴定出6,955个蛋白质和50,245个肽。

图3 单细胞蛋白质组学分析示意图

图4 胰岛细胞亚群间差异蛋白表达热图和富集KEGG通路

3、RNA测序技术结合单细胞蛋白质组学阐明各细胞亚群在葡萄糖耐受不良中的功能状态

ACE2^low α细胞可能代表低容量、脆弱和对HFD应激易感性的状态

为了探索ACE2为基础的α细胞异质性的分子特征，在Ace2^low和Ace2^high亚群之间鉴定出379个DEGs，KEGG分析显示，DEGs优先富集于氧化磷酸化、代谢途径、α细胞分泌功能相关途径和程序性细胞死亡、增殖途径，表明Ace2表达可以区分不同功能和生存状态的α细胞。与Ace2^high亚群相比，Ace2^low亚群与α细胞功能相关的基因表达下调，与β细胞特征相关的基因表达上调。这表明Ace2^low亚群可能代表未成熟的α细胞，这些细胞似乎具有β细胞样特征。单细胞蛋白质组学进一步分析了ACE2^low α和ACE2^high α细胞HFD组和CD组之间的DEPs和富集KEGG通路。ACE2^low α细胞中下调的DEPs数量比ACE2^high α细胞多，且这些下调的DEPs富集在更多与代谢相关的通路中。这表明ACE2^low α细胞更容易受到高热量应激的影响，可能是一组低容量、脆弱的α细胞，而ACE2^high α细胞可能代表小鼠的主要功能细胞群，它们能够更好地承受高热量应激。

CD81^high β细胞可能代表功能较弱的未成熟β细胞

为了分析β细胞的异质性，研究将β细胞聚为9个簇，并鉴定出前10个标记基因。研究发现CD81在β细胞簇中有差异表达，然后将9个β细胞簇分为CD81^low和CD81^high亚群。CD81^low亚群相对于CD81^high亚群，DEGs和富集的KEGG通路显示细胞代谢通路以及一系列应激相关的炎症通路均显著富集。关键的β细胞转录因子Mafa和β细胞成熟标记物在CD81^low亚群中有高mRNA表达，而未成熟β细胞标记物在CD81^high亚群中有高表达，这表明CD81^high亚群可能代表了一组功能弱且未成熟的β细胞。

为了进一步探索HFD对β细胞亚群的影响，FACS显示与CD小鼠相比，HFD小鼠中CD81^high β细胞的比例下降。在CD小鼠中检测到869个上调和373个下调的DEPs，在HFD小鼠中检测到707个上调和312个下调的DEPs（图5a、b）。CD81^low亚群中与能量代谢相关的途径都被下调（图5 c、d）。HFD和CD β细胞的scRNA-seq中，参与这些通路的下调的DEPs也降低了，结果反映了转录组和蛋白质组的一致性。此外，在CD和HFD小鼠中，与β细胞成熟和功能维持相关的关键转录因子PDX1在CD81^low细胞中相对于CD81^high细胞显著上调（图5e、f），在CD81^low细胞中，内吞作用、吞噬体、蛋白酶体和突触囊泡循环通路中富集的DEPs大多上调，表明CD81^low细胞处于更成熟的状态。

图5 β细胞亚群功能的单细胞蛋白质组学鉴定

HFD增强了成熟GLUT2^low δ细胞的功能

尽管Slc2a2（编码GLUT2）是β细胞的标志基因，但研究人员仍然在scRNA-seq中发现了一小群Slc2a2相对高表达的δ细胞，因此将δ细胞分为Slc2a2^low和Slc2a2^high亚群。根据Slc2a2^low亚群和Slc2a2^high亚群中的DEGs和富集通路，上调通路与钙离子和激素分泌有关，提示Slc2a2^low亚群可能功能更成熟。来自CD和HFD小鼠的FACS分选GLUT2^low和GLUT2^high δ细胞亚群（每个样品3,000个细胞）用于单细胞蛋白质组学分析，KEGG分析显示，与β细胞相似，在CD小鼠中GLUT2^low细胞中，相对于GLUT2^high细胞，氧化磷酸化和阿尔茨海默病通路显著下调（图3c）。CD和HFD小鼠GLUT2^low细胞中的多种营养代谢途径也显著上调（图3c，d）。内质网相关途径的内吞作用和蛋白质加工也是如此，表明GLUT2^low亚群的代谢更活跃。在GLUT2^low δ细胞中，比较HFD和CD小鼠，代谢相关通路、钙信号通路、胰腺分泌、胰岛素和胰高血糖素信号通路显著上调，表明HFD促进了GLUT2^low δ细胞的能量代谢。综上，GLUT2^low δ细胞可能比GLUT2^high δ细胞更具有功能和代谢活性，HFD进一步刺激GLUT2^low δ细胞的功能和代谢。

图6 δ细胞亚群功能的单细胞蛋白质组学鉴定

总 结

ACE2、CD81和GLUT2作为表面标记物分别区分成熟度和功能状态不同的α、β和δ细胞亚群。在HFD诱导的葡萄糖耐受不良中，低容量和未成熟的ACE2^low α细胞比例随着功能活跃和成熟CD81^low β细胞比例的增加而增加。成熟的GLUT2^low δ细胞功能增强，但比例不变。这些动态变化揭示了胰岛在HFD应激下的代谢可塑性，这种可塑性适应可以通过抑制α细胞的高血糖效应，增强β细胞的低血糖效应，以及增加δ细胞对α和β细胞的调节来抵消代谢应激，恢复葡萄糖稳态。因此，靶向上述标志物改变胰岛亚群分布，以增强胰岛功能可能是治疗糖尿病的有效方法。

图7 小鼠胰岛细胞（α、β和δ）亚群在HFD诱导下的胰岛功能紊乱

科技君点睛

本研究利用单细胞RNA测序技术（scRNA-seq）在HFD诱导的葡萄糖耐受小鼠模型中鉴定α、β和δ细胞亚群标记物，通过流式细胞仪和免疫染色对各亚群的比例进行分类和评估，并对分选细胞进行单细胞蛋白质组学分析，通过蛋白表达深入阐明各α、β、δ细胞亚群在葡萄糖耐受不良中的功能状态。

随着基于质谱的蛋白质组学发展，结合成熟的单细胞分离分选技术，单细胞层面的蛋白质组学研究已经有了大量技术层面的积累，从单细胞水平对生物体的遗传信息和蛋白表达、以及新陈代谢的研究，对于精准医学来说意义重大。华大科技质谱平台可提供单细胞蛋白质组学、空间蛋白质组学服务，同时还提供蛋白质组+代谢组、蛋白质组+转录组、常规蛋白质组+磷酸化蛋白质组学等一系列多组学关联分析服务。华大质谱平台不仅提供高质量的检测分析服务，同时也提供专业的技术支持，可为广大科研用户提供完善的方案设计。

同时，华大科技结合自主单细胞DNBelab C系列单细胞平台，可以提供一站式单细胞核酸测序服务，从单细胞RNA测序方案设计，到样本取材选样及邮寄方式建议等；并可以提供组织解离以及流式细胞分选服务，结合DNBSEQ™高保真测序，采用多种分析思路，为单细胞规模化研究及发文之路提供最优解决方案。

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参考文献：

[1] Control of insulin secretion by cholinergic signaling in the human pancreatic islet. Diabetes. 2014

[2] Urocortin3 mediates somatostatin-dependent negative feedback control of insulin secretion. Nat Med. 2015

[3] δ-cells and β-cells are electrically coupled and regulate α-cell activity via somatostatin. J Physiol. 2018

[4] Body-mass index and obesity in urban and rural China: findings from consecutive nationally representative surveys during 2004–18. Lancet. 2021

[5] Epidemiology and determinants of obesity in China. Lancet Diabetes Endocrinol. 2021

[6] Ethnicity-specific BMI cutoffs for obesity based on type 2 diabetes risk in England: a population-based cohort study. Lancet Diabetes Endocrinol. 2021

供稿：Carol

编辑：市场部

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