最新应用！NEPA21电转仪助力CAR-T细胞疗法的安全性探究丨医麦黑科技
通讯文
近年来，肿瘤免疫治疗领域的新技术发展迅速，嵌合抗原受体（chimeric antigenreceptors）T细胞（CAR-T）介导的免疫治疗，对于B淋巴细胞白血病和淋巴瘤患者的临床疗效取得了突破性进展，使得许多晚期的，复发性和难治性患者，重新获得完全缓解。
针对肿瘤细胞特定抗原的嵌合抗原受体（CAR）-T细胞治疗是一种很有前途的肿瘤免疫治疗手段。针对CD19分子的CAR-T细胞治疗在高度难治性B细胞肿瘤患者中取得了相当大的成功，各种CAR-T细胞产品也正在扩展到治疗其他癌症，包括髓系恶性肿瘤和实体瘤。
尽管CAR-T细胞治疗白血病取得了临床成功，但在CAR-T细胞治疗的早期临床试验中，学者们发现了相当多且往往危及生命的细胞毒性。一些主要的细胞毒性包括细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）。以显著的免疫细胞反应为特征，不管它们是由CAR-T细胞还是由其他受体免疫细胞引起的，它们都发生在炎症细胞因子分泌之后。
另一个由于"靶向/非靶向"或"非靶向"效应而产生的严重细胞毒性是CAR-T细胞对正常组织的意外攻击。理想情况下，转基因T细胞的靶抗原应仅在肿瘤细胞上表达；然而，大多数靶点是通常在正常细胞上表达的抗原。此外，即使这些共同抗原在正常细胞上以极低水平表达，当这些抗原被T细胞识别时，也可能发生严重的毒副作用。
因此，该领域的一个相当大的挑战是确定包括危及生命的非肿瘤和非靶向毒性的安全性规范。近期，日本学者Dr. Hirokazu Morokawa及其团队发现粒-巨噬细胞集落刺激因子受体（GMR）是治疗急性粒细胞白血病的一个很有前途的CAR-T细胞治疗靶点，尽管它也表达于包括单核细胞、巨噬细胞、和血管内皮细胞等的正常细胞。
该团队利用食蟹猴外周血单个核细胞建立了由piggyBac转座子介导的人GMR（hGMR）特异性CAR-T细胞，这些细胞重定向到人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）受体（hGMR），在髓系恶性肿瘤亚型中高度表达，并在小鼠异种移植模型中显示了它们的抗肿瘤作用。
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如图1所示
这是piggyBac转座子介导的hGMR-CAR-T细胞产生方法，hGMR-CAR通过piggyBac转座子系统转染PBMCs。第3天，将细胞与来源于PBMCs的iDCs、IL-4和GM-CSF共培养72h。电穿孔T细胞与IL-7、IL-15共同培养。培养开始后14天，收集细胞并进行分析。
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如图2所示
免疫表型分析显示食蟹猴hGMR-CAR T细胞以CD8为主，干细胞记忆T细胞表型丰富，其特征为CD45RA+/CCR7+，与对照细胞相比PD-1表达降低。这种观察到的表型与人类hGMR-CAR T细胞的表型一致（图1d）。这些结果表明，PB修饰的食蟹猴hGMR-CART细胞的特性与人hGMR-CART细胞相似。
其次，该研究发现食蟹猴hGMR-CAR-T细胞过继转移无明显细胞毒性。
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如图3所示
这是用CAR-T（A）和对照T细胞（Ctrl）（E）处理过的猕猴在过继移植前和移植后指定天数的全血细胞计数和血液化学的代表性数据。灰色阴影区域表示每个猕猴指标的特定正常范围（丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、肌酸磷酸激酶、C反应蛋白、血红蛋白、乳酸脱氢酶、单核细胞、中性粒细胞、白细胞）；与hGMR-CAR-T细胞相关的明显器官毒性在研究期间未有观察到。
第三，食蟹猴hGMR-CAR-T细胞在体内被短暂轻度激活，但不引起C明显的CRS（细胞因子释放综合症）。
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如图4所示
这是食蟹猴hGMR-CAR-T细胞或对照T细胞过继转移前和过继转移后指定天数的血浆白细胞介素（IL）-6的水平变化。在第2天，在一只注入CAR-T细胞的食蟹猴中观察到IL-6表达水平的短暂而轻微的增加，该食蟹猴的外周血中CAR转基因的拷贝数最高，表明CAR-T细胞在体内的短暂激活。然而，这只食蟹猴没有出现任何与CRS相关的症状。在体内也没有观察到CAR-T细胞的强劲扩张，而这在肿瘤负担高的患者中，通常是很明显的，并与CRS的发病率有关。
用于免疫治疗的肿瘤抗原应理想地仅在肿瘤组织中表达，而在正常组织中很少表达或不表达。然而，现时以CAR-T细胞或单克隆抗体为靶点的大多数抗原在正常组织和肿瘤组织中均有不同程度的表达。hGMR-CAR利用天然hGMR配体（GM-CSF）作为抗原结合位点，GM-CSF优先与GMR的活性形式相互作用，因而hGMR-CAR-T细胞不具备细胞毒性，这也提示我们在非活性组织中表共表达的肿瘤抗原可作为免疫治疗的替代靶点。
该研究结果表明hGMR-CAR-T细胞不具有明显如骨髓抑制、单核细胞减少和血管炎等的器官毒性；同时也证明了利用非人灵长类动物模型（NHP）在临床试验前通过研究非肿瘤/非靶向毒性副作用来评估CAR-T细胞产品安全性是行之有效的。
值得一提的是，在本研究当中，使用的是细胞电转仪正是NEPA GENE的NEPA21电转仪。
NEPA21高效基因转染系统采用全新设计的电转程序，特别适用于难转染细胞、离体组织或动物活体的转染。配合独有的电压衰减（Voltage/Decay）设计，可在获得高转染效率的同时，提高细胞存活率。专门针对难转染的原代免疫细胞、干细胞、神经细胞、活体动物、受精卵及宫内胚胎等转染，已有多篇文献支持，是细胞免疫、基因编辑等研究中常用的电转系统！
【1】采用全新设计的电转程序，电压衰减（Voltage Decay）模式；基因导入+反向导入模式。
【2】不需要特殊转染试剂辅助，节省实验成本；电转程序中的各项参数实时可见、可调，特别适用于优化原代细胞、非常见细胞的电转参数。
常用配件图片
注：NEPAGENE共有250多种电极可选，支持订制
参考文献
1.Autologous non-human primate model for safety assessment of piggyBac transposon-mediated chimeric antigen receptor T cells on granulocyte–macrophage colony-stimulating factor receptor 2020; 9: e1207
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