学10X，你不得懂点FCM？

最近在看单细胞方面的文献，总是时不时出现流式细胞术（FCM）的图，比如纽约大学医学院在Nature上发表了题为“The bone marrow microenvironment at single-cell resolution”的文章，解析了单细胞分辨率下的骨髓微环境。

又比如北京大学张泽民老师课题组在Cell发表的关于单细胞测序刻画肝癌免疫微环境动态特征的研究《Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma》。

再或者耶鲁大学研究人员在Nature发表的采用流式细胞术与高通量单细胞免疫组库测序技术研究生殖道抗病毒感染的机制《Migrant memory B cells secrete luminal antibody in the vagina》。

发现流式细胞术（FCM）总是和高分文章相伴相随。而在google搜索Single cell的时候也总是出现流式细胞仪相关的介绍。

那么流式细胞术FCM到底是什么？

它对于我们做单细胞方面研究到底有哪些帮助？

我们到底怎样解读流式细胞仪的结果呢？

这一切的答案都要求我们对流式细胞仪有一个基本的了解。

什么是FCM

流式细胞仪细胞术简单来说是一种利用流式细胞仪快速精确对细胞等生物粒子的理化及生物学特性（细胞大小、DNA/RNA含量、细胞表面抗原表达等）进行定量分析和分选的新技术（如下图）：

FCM对单细胞研究的作用

针对于Droplet-based的单细胞技术，通过流式分选做进阶式的研究：

• 让单细胞测序更有深度

• 对高通量测序绘制的细胞图谱进行辅助验证

• 对死细胞进行过滤有助于减少样本中死细胞的比例，提高实验的成功率

下面我们来看两个例子。

FCM在细胞生物学、肿瘤学、免疫学的单细胞水平研究中有着极其重要的作用。比如仅仅根据流式细胞仪前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）就可以区分外周血中的淋巴细胞（Lymphocytes）、单核细胞(Monocytes)和中性粒细胞(neutrophil)。

还比如免疫发生异常时会导致机体免疫紊乱并产生病理变化。FCM可以通过同时检测一种或几种淋巴细胞表面抗原，将不同的淋巴细胞亚群区分开来，并计算出它们相互间的比例，通过对病人淋巴细胞各亚群数量的测定来监控病人的免疫状态，并指导治疗。

例如下图淋巴细胞的检测，CD4（辅助T细胞表面抗原受体）、CD8（杀伤性T细胞表面抗原受体）双阳性的细胞比例由80.5%变成了60.6%，CD8 阳性细胞群比例由4.63%变成了5.92%，CD4阳性细胞群比例由10.9%变成了15.7%。

知道了FCM是研究单细胞的利器，那么让我们来简单看一下FCM的原理。

FCM的原理

FCM是流式细胞仪根据细胞的特性，将光信号转变为电信号，最终转换为数字信号，如下图。

而光信号的核心在于前向散射光FSC和侧向散射光SSC，如下图。

在实验中常常采用FSC和SSC来区分细胞群体，并去除细胞碎片、死细胞、粘连细胞的干扰，以及用药前后细胞的变化。

与免疫标记技术相结合

此外，另一个核心技术是免疫标记技术（immunolabelling technique）。免疫标记技术是指用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或者电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或者抗原进行的抗原抗体反应。

能够检测以下几种荧光信号：

• FL1 （第一荧光）：FITC

•  FL2（第二荧光）：PE

• FL3（第三荧光）：PerCp，PeCy5等

• PL4（第四荧光）：APC

例如nature 爆文《通过单态性MHC I类相关蛋白MR1可实现普遍性T细胞肿瘤靶向》。

其中对CD3采用PerCp染色，对CD4采用APC进行染色，发现了一类神奇的T细胞系MC.7.G5，它在一种肺癌细胞系—-A549细胞的刺激下能够发生增殖，说明这个T细胞克隆能够识别A549肿瘤细胞并产生反应。图中，从外周血中分离到对癌细胞A549产生反应的MC.7.G5细胞克隆，细胞数量增殖7倍。

如何解读流式的结果

简单的介绍了原理，我们再回过头来，看一下我们在做流式或者看到文献中流式的结果，到底该如何解读。

FCM结果的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。由数据还可以做出标准曲线进行定量分析。

单参数直方图

每一个细胞单参数的测量数据可以整理成统计分布，以直方图的方式来显示。在图中，横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，其单位是道数（channel），可以是线形（line）或者对数（log）。纵坐标一般是相对细胞 / 粒子数（count）。

二维图

在二维图的中，横坐标 / 纵坐标都表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，可以是线形（line）或者对数（log）。双参数图可以将样品细胞群分开，从而方便对感兴趣的细胞进行分析。

哈哈哈哈，写到这里，想必大家对流式有了初步的认知，下次再看10X文献的时候，这块儿应该是不愁了~~~

参考文献：

[1]. Tikhonova, A.N., Dolgalev, I., Hu, H. et al. The bone marrow microenvironment at single-cell resolution. Nature 569, 222–228 (2019). https://doi.org/10.1038/s41586-019-1104-8

[2].QimingZhang.et al. Landscape and Dynamics of Single Immune Cells in Hepatocellular Carcinoma . https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.10.003

[3].Oh J E, Iijima N, Song E, etal. Migrant memory B cells secrete luminal antibody in the vagina[J]. Nature,571, 122–126(2019).

[4]. Crowther, M. D. et al. Genome-wide CRISPR-Cas9screening reveals ubiquitous T cell cancer targeting via the monomorphic MHCclass I-related protein MR1. Nat Immunol21, 178-185,doi:10.1038/s41590-019-0578-8 (2020).

作者：biofan

审稿：童蒙

编辑：angelica

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