肿瘤全外显子测序实验技术要点

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人肿瘤外显子测序常见的样本类型有新鲜组织、FFPE样本、血液等，目前国际上推荐肿瘤组织样本与正常细胞样本（实体瘤可选择外周血，血液系统肿瘤可选择唾液、口腔脱落细胞或皮肤组织等）配对检测，以排除遗传背景干扰，识别体细胞突变。

DNA的提取主要是将DNA与蛋白质、多糖、脂肪等生物大分子物质分开，在提取DNA是应遵循以下原则：保证DNA分子以及结构的完整性，去除其他分子污染。

DNA提取一般包括细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。其中FFPE样本因经过甲醛固定、石蜡包埋处理，长时间存储等，提取出来的DNA片段常降解比较严重，DNA总量和纯度也比较低。

影响FFPE样本中DNA质量的因素有：

（1）甲醛使核酸与蛋白发生交联，影响核酸质量；

（2）甲醛可诱发DNA加合物的形成，导致氨基间形成亚甲基桥，抑制双链DNA变性，影响PCR扩增效率；

（3）可能出现脱氨基和脱嘧啶的位点（无碱基位点），模板链断裂，PCR扩增过程中碱基无法引入；

（4）磷酸二酯键水解（链断裂），DNA降解；
（5）胞嘧啶脱氨基，人工引入C>T和G>A变异，导致假阳性。

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肿瘤全外显子检测测序中，文库构建应具有以下特点：高片段转化效率；低背景噪音；低污染水平；低偏好性。

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高片段转化效率

片段转化效率是指最终能测到的文库片段数（不含PCR重复）占起始样本中DNA片段数的比例。

文库是否理想的标准就是文库复杂度。文库复杂度越高，代表样本文库包含更多的样本原始信息，最终靶区域会获得更有效的测序数据覆盖。文库复杂度也称为文库丰度，由起始DNA量、DNA质量和片段转化效率决定。

当起始DNA量相同，DNA质量接近时，片段转化效率越高意味着文库复杂度越高。所以在建库体系建立过程中应进行多个环节的评估和测试优化，保障较高的片段转化效率。

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低背景噪音

NGS检测过程中或多或少会引入碱基错误，如PCR过程错误碱基引入，测序仪不同碱基信号干扰带来碱基读取错误、高GC区域、同源或低复杂度的区域等。这些会给真实的低频突变检出带来很大的背景噪声干扰。

文库构建过程中，通过对DNA片段两端加入独特的分子标签，保证来源于每一条原始DNA模板正反链的扩增片段都可以被标记，最大限度地过滤背景噪声。

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低污染水平

文库构建过程中，通过PCR或接头给样本片段引入标签，如果检测过程中发生标签错配，或在生物信息分析过程中将一份样本数据拆分至另一样本中，都会造成样本交叉污染。

在低频突变检测中，对样本交叉污染的控制显得尤为为重要。目前illumina测序平台采用的是ExAmp扩增方式，加上多样本混合上机很容易带来标签跳跃（index hopping），造成样本间交叉污染。

建议使用双端index进行文库构建。通过双标签识别一个样本，降低样本交叉污染发生率。

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低偏好性

选择合适的高保真酶并调整至合适的PCR扩增循环数，降低扩增偏好性。

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在设计肿瘤相关的基因检测探针时，一般考虑检验项目的目的、检测成本、靶区域序列特点、临床意义等。捕获区域越大，意味着需要越大的数据量和越高的检测成本。

目前Agilent、Roche、Twist等芯片厂家都推出了多个版本的全外显子检测芯片，比如只包含核心外显子区域30M左右的芯片，也有包含外显子区域及侧翼区域的60M左右的芯片，可根据检验目的及检测成本进行选择。

此外，在探针设计时，一般会加入几十个不等的人群中杂合度较高的单核苷酸（SNP）位点作为后续实验中避免样本之间混淆的质控点。

作者：oct

编辑：angelica

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