国庆特辑||美国玉米诱变(花粉EMS)育种的商业化实施典例

编辑 | 新锐恒丰研究院

来源 | 玉米科学2017，25(3)：19～22

作者 | 张铭堂，才卓

提要：

科学的发明、进步与创新，虽然多多少少带有一些运气，每个人能够在面对问题时的明确认知目标、周密的思维设计、成熟的操作技巧、把握机会的能力以及面对挑战的信心与勇气，则是成功的必要条件。本文就张铭堂先生本人在英国普内门公司成功进行玉米花粉EMS(甲磺酸乙酯)诱变遗传育种案例的策划、实施过程及分析结果，提供给年轻育种家一些可供参考的成功经验。

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1985 年，英国普内门公司(Imperial Chemical Industries，ICI)购买了美国高斯德种业(Girts Seed Company)作为介入美国种业及生技科研发展的桥梁。普内门公司招聘大量科技专家，包括遗传育种、分子遗传、转基因、生理生化、昆虫病理、电脑资讯和农艺机械等专业人才，与英国 Jealott’s Hill 成立的生物技术中心，助推作物科研发展，在美国建立了 20 个育种站，主要从事玉米、大豆、高粱及向日葵等品种选育。该公司是典型的欧美作物种业科技融合背景与基础，考究其商业化研发历史对刚刚步入国际竞争的中国种企及育种家具有借鉴意义。

1.研发工作的背景

1986 年 8 月，作为公司新聘年轻专家前往英国开会，主题是确定未来科研发展目标。公司首先对各领域的科技专家进行个性测试，测试结果显示，不怕风险的个性是这批年轻专家的精神风格，其中，只有两个专家（包括作者）性格低调沉稳，劳资部门管理人员称之具有弥补计划缺陷与漏洞的天赋，能够在大家浮躁的氛围中提出切实可行的新思路。会议最后讨论耐Pursuit 除草剂[咪脞啉(Imidazoline)成分类]转基因研发项目，讨论在如何设计这个转基因上没有明确思路。最后作者建议，为什么不试试花粉化学诱变，从中筛选显性抗除草剂突变基因，整个会场安静无声，最后话题转移不得结论。会议之后，转基因计划经理找到作者问：“你确定可以做吗”，作者说：“可以，但是需要资金以及人力、物力支援”。计划经理说：“这都不是问题，只要你能做出诱变，我就可以筛选出来”。就这样，研发管理部半年之久多次会议探讨的重要项目调整了方向。回到美国后作者意识到，自己挑战了高难的研究课题。

2.设计思路

当时玉米花粉化学诱变效果已经明确，隐性基因突变率大约在 1/600～1/1 000，显性基因突变率大约是万分之一，但技术还很不成熟，作为商业化目的性很强的种业公司来说，诱变育种面临的突变方向非常不确定性等系列问题，很难有人涉猎，特别是大规模的玉米花粉 EMS 诱变育种更是无人尝试。

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首先基础材料选用当高斯德种业(Girts Seed Company)市场销售数量最大商业化杂交种 G8532 的父本 UE95，其特点是适应性广、丰产性好、果穗 20～24 行、结实性好、结实粒多，每穗粒约 500 粒，雄花散粉性好，花粉数量大，已组配出多个商业化组合应用于生产。

诱变方法将 0.03 ml 甲磺酸乙酯(Ethyl Methane⁃sulfonate，EMS)化学诱变剂与 45 ml 轻质石蜡油(Light Mineral Paraffin Oil)均匀混合。溶液浓度是 0.066 7% EMS，将3 ml 左右新鲜玉米花粉粒倒入 EMS 溶液，均匀混合摇动 40 min，再将花粉溶液倒在花丝上，每瓶 45 ml 的溶液，可以授粉 50 穗左右。

2.1 计划准确适宜的作业规模，确保获得预期的突变效果

通常诱变学术研究的诱变作业规模都很小，大约处理 100 穗自交系，平均每穗诱变产生 50 粒以上 M1(Mutagenized 1st Generation或诱变第 1 代)种子，总共 5 000 粒 M1 种子。但对公司商业化育种来说，这样的规模远远没有成功的把握。根据节省人力、财力及物力原则，计划确定最佳诱变处理果穗数 3 000 穗，预计获 15 万粒 M1 代种子，用抽样突变概率统计计算，能够诱变出显性抗除草剂基因突变株。如果要得到 3 000 株健康植株，实际选定种植数量是 4 000 株，其中，200 株用来提供花粉并自交，其余 800穗为淘汰虫食、劣穗留选拔弹性。

2.2 保障无花粉污染的授粉环境，确保突变来自诱变处理

如果拟诱变处理的种子正常春播种，开花期将与周边玉米花期相遇，空气中遍布花粉，很难阻止外源花粉污染要诱变处理的果穗。因此，选择使用时间隔离方案，以消除外源花粉污染问题。4 月中旬(比所有田间正常播种早 15 d)，将 4 000 粒种子在温室育苗钵里播种，等到田间气温升高开始播种时，将所有幼苗(4～5 片叶龄)移栽田间。苗期精细管理，追肥两次，确保植株生长整齐健壮，结果在 6 月 15 日开花，比其他玉米早 14 d 抽穗。为了避免自交污染，雌穗全部抽丝前套袋，3 500 株拔除雄花穗，雌穗待诱变处理，剩余 500 株雄花穗作为花粉源。6 月中旬周边完全没有玉米花粉污染，直接使用筛网就可收集花粉及清除花药，保障了快速收集大量花粉及诱变处理作业能够顺利进行。

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2.3 管控整套过程流畅有序，按技术参数要点准确实施

能否保证使用适宜花粉、最佳时间完成授粉、花粉处理时间精确、保证获得诱变效果等系列问题都会影响成败，这是大规模诱变作业的瓶颈问题。计划处理 3 200 穗，每天 800 穗，需要 16 瓶 EMS 或甲磺酸乙酯花粉诱变溶液(每瓶授粉 50 穗)，花粉要当天采集，加入 EMS 诱变液，再不间断摇动40 min 混匀。具体方法是用汽车雨刷马达改制个 8 支架转盘，转速 60 次/min，汽车电瓶为动力，手提移动田间，解决了田间自动摇动溶液的问题。实际操作步骤是将最先收集的 3 毫升花粉及效应 EMS 诱变液先后倒入第 1 瓶，封闭之后，放在转盘自动转动混合，每隔 5 min，将当场收集的 3 ml 花粉及 EMS 诱变液先后倒入下一瓶，封闭瓶子放转盘转动；持续进行到第 9 瓶时，第 1 瓶已处理 40 min，取下第 1 瓶，并将第 9 瓶放上转盘转动，花粉诱变溶液保证在 4 min 内授粉 50 穗左右后，向记录员报出授粉果穗数量，也是通知助手传递第 2 瓶授粉液。此时，可放松 10～20 s 空闲时间，擦擦汗，清理安全眼镜、口罩、防护衣及手套。为确保整套流程作业流畅，每个操作环节紧张有序交接，操作人能够机动的时间空间有限。任何一步延误或提前，处理的花粉就会降低诱变几率或逐渐失去活力，这是很多进行诱变育种不得高效甚至失败的原因。因此，每个人的心理压力都很大，连研发经理也跑来帮忙。保证了每天从上午 9 时整开始，9 时 40 分开始授粉，上午 11 时最佳授粉时间内结束授粉。最后助手清理善后，检查授粉果穗是否套袋严实，并用书针固定，收集药物污染的瓶子及保护衣物，交给危险物品处理部门处理。

2.4 超前做好相关各项准备，保证诱变操作快速高效

花粉诱变溶液4 min内完成50穗授粉速度要求很快，剩余的时间很少，只有几秒钟的间隔，所以，准备工作非常重要。为解决花丝吐丝长短不一致问题，避免花丝不齐而影响诱变效果及授粉速率，提前1天将所有雄花穗去雄，最大限度地避免未处理花粉的污染；同时，将900余穗出丝果穗的花丝从顶部0.5 cm左右处剪除，并将套袋回折作为记号，利于次日能够快速找出可授粉的花丝剪切穗，不为寻找适合授粉的果穗浪费时间。

3 鉴选与应用

总计使用 EMS 化学诱变的果穗数目是 2 635 穗，收获果穗数目是 2 230穗，脱粒后约 25 万粒 M1 种子。每穗平均结实 112 粒，比事先预计的结果要好很多。

3.1 诱变效果初步观察

1987 年 11 月，从收获 M1 种子里面取 2 000 粒次级样品与 200 粒正常种子(对照)，送到夏威夷试验站种植，自交获得 1 485 个 M2 代果穗及 120个正常果穗。正常种子没有经过诱变处理，没有可见突变基因。从M2代诱变处理果穗发现，1 044 穗有子实突变基因，573 穗有幼苗及植株突变基因。在子粒突变体中，糯基因突变体有 3 个。总突变的频率是每一基因组有1.089 基因突变事件。

3.2 目标突变体的筛选

1988 年，25 万粒 M1 种子送到英国伦敦普内门 Jealott’s Hill 研究中心，使用 10 万余粒用来测试对 Pursuit 除草剂的抗性。在温室环境条件下，种子均匀散布于 10 kg 沙壤/育苗箱中，幼苗在 3～4 叶片时，使用 1 mol/L 浓度的咪脞啉(田间施用剂量的 5 倍溶液)自动化喷药设备，均匀喷洒幼苗叶片，育苗箱底部没有排水孔，避免除草剂流失，幼苗放在温室环境 10 d 后，检查抗除草剂植株的存在。结果从 10 万株幼苗里面，发现 10 株绿色幼苗(不抗除草剂株幼苗变成白色；如果抗除草剂，幼苗保持绿色)。移植后给予精细管理获得自交果穗，测试证实是抗咪脞啉除草剂显性基因突变体。

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3.3 目标基因的商业化应用

1989 年，利用该突变体选出没有明显携带不良基因同时主要性状及配合力最接近原来自交系 UE95 的抗除草剂同源系 UE95IT(Isogenic Line)；1990年，使用这个抗除草剂自交系生产出全球第一个抗除草剂咪脞啉的杂交种G8532IT，1991 年进入商业化推广。其后，高斯德成为全球唯一具有显性耐除草剂基因专利的公司，陆续商业化生产销售一批带有IT 耐杀草剂基因的新品种，创造了可观的经济效益。同期，先锋公司推出的是隐性耐除草剂基因，需双亲同时携带，并对产量有一定影响。直至 1993 年孟山都推出转基因抗除草剂基因，开始了转基因玉米新时代。

3.4 突变群体的拓展应用

根据试种结果，发现诱变出的这批种子含有丰富的遗传突变，初步估计至少包括 15 万个隐性基因(总突变率是 1.089/基因组)及至少 15 个显性基因。

因此，对该批诱变种子应用不同的鉴定方法、不同的测试手段，再进行鉴定筛选还可以获得具有其他性状的突变体，也就是还可以衍生其他育种计划。Jealott’s Hill 研究中心计划再使用剩余近 15 万粒 M1 种子筛选不同类型的抗杀草剂显性基因突变体。但遗憾的是放在地下仓库的这包种子神秘 48 31758 48 15287 0 0 3277 0 0:00:09 0:00:04 0:00:05 3277失踪，后续计划也就没有再继续进行。

4 多年育种经验总结

在密苏里大学攻读学位期间，师从玉米遗传育种学家纽佛 (Dr.M.G.Neuffer)教授，开展化学诱变、物理诱变育种研究，获得 1 500 余个隐性、显性遗传突变体材料，从学习使用不同诱变技术来产生新的基因突变群体，到连续多代鉴定筛选这些突变基因的性状表现，大量枯燥乏味、耗时费力的田间表现型鉴定及实验室基因定性分析，让作者累积了足够丰富的实践经验，能够对诱变方法、诱变效果及突变基因表现型性状趋势了解比较深刻。拥有这些经验在田间能够看到其他人看不见或者容易错过的遗传性植株异同及性状差异，也能够排除环境影响所掩盖的表型特性。因此，田间是培养育种家成长的大教室。

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物理射线、化学药剂诱变创造玉米遗传变异的效果早已明确，但始终没有育种公司将其作为主体技术应用。原因是生物遗传保守性很强，玉米约 35 000 个基因，复制过程非常精确稳定，偶发的低概率核苷酸错误组合替换产生基因突变的概率仅百万分之一左右，并且大部分变异为隐性或不能鉴定的沉默突变(Silent Mutation)。研究证明物理、化学诱变能够提高变异几率，产生各式各样的突变，但与常规系谱法相比突变方向具有不确定性，所以，多数育种家不愿采用。但对选育显性抗除草剂品种这样填补空白意义的特殊研发目标，选择 EMS 花粉诱变技术路线是最佳选择，能获得常规系谱育种难有的效果及特异材料。

科技发展至今，种业科技竞争形势日趋激烈，以往的经验远远不能解决当前复杂多变的种业难题，必须再发展与再创新。商业化研发要确保全球领先，就必须重视产品的市场独占性及效益回报率，公司为增大成功几率，确保开发一流产品，会对有前景的项目大量投资。所以，任何商业化育种研发计划都不同于科研课题的论文设计，必须事先明确技术路线及其可行性，针对关键环节的制约瓶颈反复斟酌实施方案，详细列出可能导致失败发生的风险及其问题解决途径。在此基础上，研制高效实用的处理器械提高作业效率、发掘切实可行的鉴定方法增加鉴选准确性等愈来愈显得重要。

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商业化诱变育种需要把握的基本要素，要有成功的信心及勇气挑战高难的育种家；详细周密的实施计划突破制约瓶颈环节；选用遗传基础好及广适应能力的基础材料；把握适度余地的实验规模实现耗资合理；研制高效实用的处理器械提高作业效率；发掘切实可行的鉴定方法增加鉴选准确性。

参考文献：(略)

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