BioArt原创丨肿瘤细胞中miRNA表达量为何整体降低？Cancer Cell告诉你答案
11月14日，最新一期《Cancer Cell》杂志报道了来自俄亥俄州立大学、台湾大学和四川大学等单位发表的题为“ERK Activation Globally Downregulates miRNAs through Phosphorylating Exportin-5”的文章，文章通讯作者为美国科学院院士Carlo M. Croce，四川大学生物治疗国家重点实验室彭勇教授为本文共同通讯作者。
Carlo M. Croce教授（现年72岁）是miRNAs与肿瘤发生研究领域的先驱和领导者，他的实验室最早建立起了miRNAs调控与肿瘤发生的关系，Croce组2002年的PNAS论文率先报道了两个miRNAs靶向作用癌基因BCL2（该基因由Carlo M. Croce最先克隆鉴定）从而导致慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, cll)发生。
有关miRNAs的背景，笔者这里简短的介绍一下。熟悉的同行应该都知道，第一个microRNA lin4是当时在达特茅斯医学院的Victor Ambros1993年最先发现的，差不多同一时间麻省总医院的Gary Ruvkun（北大分子医学研究所刘颖研究员的博后导师）在Cell报道了线虫中lin4调控lin14的工作（下图）。
当然，大约2000年Gary Ruvkun又鉴定到第二个microRNA let-7，随后有关microRNA的研究工作在不同的物种中都开始研究起来了。虽然1998年有关RNAi的研究工作诺奖委员会把奖授予Andrew Z. Fire 和 Craig C. Mello，但是同行们认为Victor Ambros、Gary Ruvkun以David Baulcombe（植物microRNA研究先驱）关于小RNA的工作值得获一次诺奖，尽管2008年他们三人拿到了拉斯克奖。可能有人会觉得这个story有点老掉牙了，不过笔者觉得谈到microRNA还是有必要把最原始的研究描述一下。（以后有机会，BioArt将详细整理一篇有microRNA科学发现小史）
上面废话了一堆好像还没进入正题。
OK，标题中事实上已经谈到了，本文的核心就是ERK活化后通过磷酸化Exportin-5从而整体下调miRNAs的表达，这暗示着调控肿瘤中miRNA的进出核有可能在临床中具有重要的意义。2005年Broad Institute的Todd R. Golub组在Nature上发文称（下图），相比于正常组织肿瘤样本中miRNAs呈现整体表达下调的趋势。
本文主要以肝癌（HCC）的发生作为研究模型，此前有研究表明肝癌的发生发展过程中miRNA的表达异常，而且miRNA的整体下调在促进肝癌转移上伴有极其重要的角色（2012，Hepatology）。2008年又有课题组在RNA上发文称肿瘤中miRNAs的水平与许多前体pre-miRNAs滞留在细胞核内有关。那么pre-miRNAs滞留在细胞核内呢？此后又有文章报道XPO5（Exportin-5）是pre-miRNA转运不可或缺的转运受体蛋白。此前也有一些XPO5与肿瘤发生相关的研究，但是具体机制不是十分清楚。接下来的故事就要从XPO5说起了。
在肝癌组织中XPO5的整体表达水平和正常组织相比没有太大差别，但是相较于正常组织XPO5在肿瘤中主要定位在细胞核（下图1），进一步发现肿瘤中XPO5的磷酸化水平是显著升高的（下图1C），接下来显然会去问是哪个激酶介导的XPO5磷酸化上升。通过过表达和荧光素酶报告体系鉴定到了ERK激活是非常重要的，CO-IP实验表明ERK和XPO5有很好的互作，通过质谱也鉴定到了ERK磷酸化XPO5的位点，而且在一组肝癌细胞系中ERK的磷酸化和XPO5的磷酸有非常好的正相关性（下图2A），敲低XPO5会导致整体的miRNA表达水平下降，这一现象能被WT的XPO5 rescue，但是XPO5磷酸化位点的突变体（模拟磷酸化）则不能（下图2B）。
图1
图2
既然XPO5敲低后miRNA整体表达量降低，那么接下来就会问到底是哪些关键的miRNA与肝癌的发生相关呢？此前有报道表明miR-122在正常的肝组织中有很高的表达量，而且XPO5敲低的肝癌细胞中通过分析发现miR-122的表达水平大幅下降，那么接下来论文中主要focus在miR-122上，并且可以将miR-122在XPO5磷酸化诱导的miRNA整体下降中作为一个代表性的指标。
因为XPO5的磷酸化导致miR-122的表达下调，而且此前的研究表明miR-122的缺失能降低肿瘤对化疗的敏感性，那么接下来很自然的会想到是否磷酸化的XPO5会产生同样的效果，很显然后面的系列实验证实了这一点。紫杉醇的耐药性能够被XPO5的突变体（模拟磷酸化）诱导，而且还可以被miR-122的过表达所逆转，当然敲低miR-122也能增加紫杉醇的耐药性。接下来就会问miR-122主要通过靶向什么基因发挥功能呢？通过分析和实验最终锁定SEPT9是miR-122的作用靶点。因为SEPT9这类蛋白能通过支架微管相关蛋白（MAP）和MARK（微管亲和性调控激酶）增加微管的动态性，所以接下来的实验最终confirm了MARK4也许是抵抗紫杉醇耐药性的一个治疗靶点。
故事到这里显然还没完，同行还会问到磷酸化如何影响XPO5的活性。在回答这个问题上，这篇文章花了不少篇幅去解决（还有结构生物学的data），最终发现是XPO5在被ERK磷酸化后，随后被Pin1这个蛋白识别并介导XPO5发生异构化（isomerization），从而破坏了XPO5装载pre-miR-122的能力。
既然文章发到Cancer Cell上，那么最后一张图一般要回归肿瘤的发生和临床预后的分析上来。显然这篇文章也不例外，通过一些肿瘤样本的分析进一步确认了ERK介导的XPO5磷酸化从而调控miR-122下调有很好的临床相关性。
最后用本文的工作模型图（下图）做一个总结。在ERK不处于激活状态下，pre-miR-122通过XPO5介导正常出核产生成熟的miR-122，miR-122随后作用于SEPT9使之不能调控MAP/MAPK，MAP4不能被磷酸化从而很好的结合在微管上，这样微管的多聚化正常而且这个情况下肝癌对紫杉醇敏感；当ERK处于活化状态时，XPO5随之被磷酸化进而通过Pin1的作用异构化而导致pre-miR-122不能正常初核成熟，这样SEP79就没有被抑制从而通过作用MARK4激酶调节MAP4磷酸化使微管解聚，最终在这个状态下肝癌对紫杉醇产生耐药性。
点评：这篇文章很好地部分解释了为什么肿瘤中整体miRNA表达水平下降的科学问题，而且在机制的阐明方面做了大量细致清楚的工作，结论清晰，行文逻辑丝丝入扣，而且中临床治疗上提出了可行的方案。事实上很多同行认为做分子机理这块Cancer Cell很多时候不如Mol Cell做得好，这篇文章显然不是，这是分子机制和临床应用结合的比较完美的一篇文章，尽管没有概念上的突破使之不能发表在CNS上，但是实际意义还是非常值得重视。
（说明：文章如有纰漏或者不正确的地方敬请同行朋友指正！）
作者简介
Carlo M. Croce，意大利裔美籍科学家，现年72岁，目前是俄亥俄州立大学杰出教授，遗传研究所所长，分子病毒、免疫和医学遗传学系主任，他还是美国国家科学院院士、美国国家艺术与科学院院士、美国国家医学院院士、美国癌症研究院首批一级院士和意大利国家科学院外籍院士，他最重要的学术贡献是发现并克隆了BCL2基因、ALL1基因、TCL1基因和首次发现miRNA与肿瘤发生的关系等，他在CNS杂志上发表文章近50篇高水平文章，论文总被引次数达十几万次，H-index超过180，他还曾担任Cancer Research杂志主编长达十年之久，目前与四川大学魏于全院士一起担任华西医院生物治疗国家重点实验室创办的英文期刊“Signal Transduction and Targeted Therapy”（Nature旗下杂志，2016年2月创刊）的主编，该杂志不仅发表细胞信号传导相关基础研究进展，也发表各种临床重大疾病靶向治疗方面相关的进展。Nature Publishing Group 出版社高度重视杂志的出版发行，计划将杂志办成一本国际高水平的生物医药杂志。
图片来自川大生物治疗国家重点实验室官网
Signal Transduction and Targeted Therapy杂志主页面截图
彭勇，博士，教授，博士生导师。1996年毕业于四川大学生物工程系，获理学学士学位；2002年毕业于四川大学生命科学学院，获遗传学博士学位； 2002年—2006年，在美国俄亥俄州立大学医学院进行博士后培训，2007年—2009年在美国哥伦比亚大学医学中心担任Associate Research Scientist，2009年-2013年，在美国俄亥俄州立大学综合癌症中心Carlo Croce院士实验室担任Research Scientist，2014年在美国加州大学圣地亚哥分校Napoleone Ferrara院士实验室工作。2014年9月，通过“国家生物治疗协同创新”进入四川大学生物治疗国家重点实验室，并入选“四川省千人计划”，主持非编码RNA实验室的研究工作，主要从事非编码RNA对基因表达调控及其在肿瘤发生发展中分子机制的研究。至今已在Molecular Cell、PNAS、JBC、Oncotarget等学术期刊上发表30余篇研究论文。
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