激烈交锋丨Darnell父子与何川关于m6A修饰的“暗战”

过去的几年里，关于真核生物信使RNA上N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine, m6A)修饰（以下简称“m6A”）的研究层出不穷，BioArt过去曾报道过数十篇相关的重要研究论文（详见文末列表），或许正是由于报道得太多了，部分读者反馈的时候通常会提到“审美疲劳”。不过，对于今天BioArt发布的这篇报道来说，相信读者会有兴趣了解m6A修饰领域的一些是是非非。

RNA具有100多种修饰，而 m6A是真核生物信使 RNA上含量最多的化学修饰之一。近年来的研究表明，哺乳动物体内m6A催化酶（甲基转移酶 复合物METTL3/METTL14/WTAP 和去甲基化酶ALKBH5 、 FTO）与m6A结合蛋白YTHDF1/2、YTHDC1的发现以及相关功能的研究证明了m6A修饰是动态可逆的，而且具有种类多样而又广泛的重要生物学意义（具体细节可参考2017年三篇重量级综述【1-3】）。

上述内容简单的把m6A的背景介绍了一番，那么好了，回到本文的标题“大佬之间的暗战”。之所以用“暗战”二字，其实是想表明m6A修饰领域还是有不少不同的声音存在，但是这种声音似乎不太大，不是这个领域的基本上不大了解。有些学术问题还限于一种争论中，到底孰是孰非目前还是各执一词（就算你知道我是“影子”，我知道你是“风筝”，但是谁能够做裁决呢？）。

2017年，Gene & Dev杂志发表了一篇来自洛克菲勒大学Robert B. Darnell（八卦一下，他是拉斯克奖得主、HHMI、RNA加工和信号转导领域奠基人James E. Darnell Jr.的儿子，曾发明了鉴定RNA结合蛋白的方法——CLIP，纽约基因组中心的创会理事兼CEO，他的妻子Jennifer Darnell是脆性X染色体综合征领域权威专家。这篇论文中Darnell父子都是通讯作者。）课题组题为“m6A mRNA modifications are deposited in nascent pre-mRNA and are not required for splicing but do specify cytoplasmic turnover”的研究论文，声称新生mRNA前体上的外显子有被甲基化（m6A）并且在核质和胞质中相同外显子的残基上都看到m6A。最后得出结论说，没有证据显示mRNA外显子上有相当程度的去甲基化，并且m6A也不是大多数剪接所必须（在缺乏甲基化酶Mettl3的小鼠胚胎干细胞中，在m6A mRNA不存在（> 90％）的情况下并未改变RNA剪接的总体状况），它只是主要决定了胞质mRNA的稳定性【4】。

在这篇论文发表之后，Darnell父子意犹未尽。前不久Darnell父子二人联手在RNA杂志上发表了一篇题为“pre-mRNA processing includes N6 methylation of adenosine residues that are retained in mRNA exons and the fallacy of "RNA epigenetics"”的评论文章（下图），这次火力比较猛，直接对“RNA表观遗传学”（RNA epigenetics）的概念提出了质疑（“All these data argue strongly against a commonly used "reversible dynamic methylation/demethylation" of mRNA, calling into question the concept of "RNA epigenetics" that parallels the well-established role of dynamic DNA epigenetics.”），并尖锐的指出这个概念会对读者产生严重误导（“seriously misleading to uncritical readers”），整个文章火药味非常浓，一批到底。主要质疑的问题在于FTO去甲基化酶的定位与功能的问题，还有对另一个去甲基化酶ALKBH5尽管在精子发生中有功能，但是并没有直接证据是由于m6A修饰的动态变化所致，当然还有其它的一些问题，归根结底在于缺乏直接的分子层面的证据证明m6A动态变化所导致的系列生物学功能。

好玩的是，RNA论文中的补充说明部分（Footnote）还援引了m6A领域的大佬——杜克大学Kate D. Meyer和康奈尔大学 Samie R. Jaffrey近期撰写的一篇题为“Rethinking m6A Readers,Writers, and Erasers”的年评（Annual Review of Cell and Developmental Biology）中的一段话，表示他们共同认为“RNA表观遗传学”这个概念提出的过早（at best premature）。引述的原文如下：

“The idea that m6A in mRNA is reversible has been an important concept. Conceivably, the activation of m6A demethylases could account for dynamic changes in m6A levels in mRNA. However, despite excitement around the concept, very few studies have explored this concept at the molecular level.”

“RNA表观遗传学”都被质疑成这样了，作为提出这个概念的学者、芝加哥大学何川教授显然不会坐视不理。何川教授也同样在RNA杂志发表了一篇题为“Our views of dynamic N6-methyladenosine RNA methylation”的评论文章，对Darnell父子的质疑进行了回应和反驳【6】（相对Darnell父子的咄咄逼人，何川等人的反驳显得“慢条斯理”）。

何川等在这篇文章中提到，他们同意Darnell父子的部分观点：大多数mRNA上的m6A修饰发生在共转录阶段，m6A修饰在其中的功能之一是影响转录本的稳定性，并且这种修饰在HeLa细胞中可能不会影响RNA的剪接。但是，尽管m6A修饰对一些细胞系中RNA剪接的影响有限，但是应该审慎地注意到m6A甲基化主要在长外显子中富集并且在具有可变剪接变体的转录本过度呈现。然后列举了最近报道的两个在果蝇中例子（两篇Nature论文），m6A能够调控果蝇性别决定（Nature：m6A调控果蝇性别决定丨BioArt国科大论坛）【7,8】。然后表示，关于m6A对RNA间接的作用需要更进一步的评估。接着，从以下三个方面进行展开回应了Darnell父子的系列质疑（具体内容，读者朋友可以下载相关论文详细阅读，限于篇幅不再展开）：

1、the occurrence and functional relevance of RNA demethylation; 

2、the implication that “regulatory” and “dynamic” events should reside primarily in the cytoplasm;

3、the general notion of “dynamic” RNAmethylation.

这里还有必要重点提一下FTO这个m6A去甲基化酶，因为FTO的功能也是争论的焦点之一。Darnell等认为FTO主要定位在细胞核，不大会在细胞质去除m6A修饰。但是何川组多次在FTO敲除的细胞中通过高灵敏度的质谱在细胞核中检测到了m6A修饰的上升，并且另一个去甲基化酶ALKBH5在精子发生过程中能够有效的去除m6A，此外他们还在细胞质中发现了tRNA上m6A的去甲基化酶。

好玩的是，2016年底康奈尔大学的Samie Jaffrey教授在Nature上还发表一篇所谓“颠覆性成果”生成FTO的真正底物是m6Am修饰而非m6A修饰【9】，这篇文章也是Darnell重点拿来佐证观点的证据之一。m6Am与m6A在结构上十分相似（下图），差别仅在于核糖2’-O上的甲基修饰。

 m6A和m6Am

Samie Jaffrey组的证据主要包括：FTO的敲除和过表达没有显著影响细胞内m6A修饰的水平；FTO对m6Am的酶活比m6A要强100倍（kcat/Km）。但是事实上是否真的这样呢？详见BioArt此前关于这个问题的专题驳斥文章《真的搞错了吗？RNA去甲基化酶FTO的作用底物解读丨特别推荐》。

笔者始终认为，正常的学术争论都是值得鼓励和赞扬的。在生命科学领域，当一个课题组去重复另一个课题组的成果时，很多时候可能都重复不出来，然后一般情况下重复不出来就作罢了，最多私下再吐个槽什么的也就过去了。但是像Darnell父子和何川教授关于m6A的理性争论用发表学术论文的方式处理是比较好的，这样对双方来讲都是一种再学习的过程，真理总是会越辩越明。突然发现，学术界很久没有没有出现这样酣畅淋漓的学术争论了。

俗话说得好，“打虎亲兄弟，上阵父子兵”，学术战场也是战场，Darnell父子上演的传奇还在继续，同时我们也期待以何川为首的科学家能够再接再厉，将“RNA表观遗传学”这个概念做的更实。

参考文献：

1、Meyer, K., & Jaffrey, S. R. (2017). Rethinking m6A readers, writers, and erasers. Annual review of cell and developmental biology, 33(1).

2、Roundtree, I. A., Evans, M. E., Pan, T., & He, C. (2017). Dynamic RNA Modifications in Gene Expression Regulation. Cell, 169(7), 1187-1200.

3、Zhao, B. S., Roundtree, I. A., & He, C. (2017). Post-transcriptional gene regulation by mRNA modifications. Nature reviews. Molecular cell biology, 18(1), 31.

4、Ke, S., Pandya-Jones, A., Saito, Y., Fak, J. J., Vågbø, C. B., Geula, S., ... & Darnell, R. B. (2017). m6A mRNA modifications are deposited in nascent pre-mRNA and are not required for splicing but do specify cytoplasmic turnover. Genes & development, 31(10), 990-1006.

5、Darnell, R. B., Ke, S., & Darnell, J. E. (2017). pre-mRNA processing includes N6 methylation of adenosine residues that are retained in mRNA exons and the fallacy of" RNA epigenetics". RNA, rna-065219.

6、Zhao, B., Nachtergaele, S., Roundtree, I. A., & He, C. (2017). Our views of dynamic N6-methyladenosine RNA methylation. RNA, rna-064295.

7、Lence, T., Akhtar, J., Bayer, M., Schmid, K., Spindler, L., Ho, C. H., ... & Roignant, J. Y. (2016). m6A modulates neuronal functions and sex determination in Drosophila. Nature, 540(7632), 242-247.

8、Haussmann, I. U., Bodi, Z., Sanchez-Moran, E., Mongan, N. P., Archer, N., Fray, R. G., & Soller, M. (2016). m6A potentiates Sxl alternative pre-mRNA splicing for robust Drosophila sex determination. Nature, 540(7632), 301-304.

9、Mauer, J., Luo, X., Blanjoie, A., Jiao, X., Grozhik, A. V., Patil, D. P., ... & Gross, S. S. (2017). Reversible methylation of m6Am in the 5′ cap controls mRNA stability. Nature, 541(7637), 371-375.

附m6A相关报道：

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