专家解读丨庄小威组在Science总结超分辨显微成像技术
解读丨苏乾、孙育杰（北京大学生命科学学院）
责编丨迦溆
早在1835年，英国科学家乔治·B·爱里（George B. Airy）就提出了“爱里斑”理论：基于光的衍射特性，即使一个无限小的发光点在通过透镜成像系统后，也会形成一个弥散的图案，称为“爱里斑”。爱里光斑在成像平面附近的三维的光强分布被称为光学系统的“点扩散函数”（point spread function，PSF）。随后在1873年，著名的德国科学家恩斯特·阿贝（Ernst Abbe）基于此原理提出了“阿贝光学衍射极限理论”（diffraction limitation），经典的公式也作为其重要成就刻于其墓碑上：
Ernst Abbe的墓碑。图片引自：https://en.wikipedia.org/wiki/Diffraction-limited_system
其中，为光学系统的分辨率（即能分辨的两点之间距离），是探测的发出的光的波长，是成像系统中介质的折射率，是物镜聚焦光锥（light cone）的半角，而又称为一个光学物镜的“数值孔径”（numerical aperture, NA）。根据这一公式，光学显微系统的分辨率极限被限制在约检测光波长的一半，200~300纳米左右（可见光波长范围400-700纳米）——即当两个无限小的点光源相距200纳米以内时，它们的点扩散函数（或是它们的爱里斑）会有很大的重叠造成无法区分的现象，即达到了光学衍射极限。
然而，曾经被认为是不可逾越的理论物理极限，在一个多世纪后的2000~2006年，被相继出现的一系列超高分辨率显微技术“打破”了。诸如“4Pi显微技术”、“基态损耗显微技术”（Ground State Depletion microscopy，GSD）、“受激辐射损耗显微成像技术”（STimulated Emission Depletion, STED）及其衍生“可逆饱和光学荧光转化显微技术”（Reversible Saturable Optical Fluorescence Transitions）、“（饱和）结构光照明显微技术”（(saturated) Structured Illumination Microscopy, (s)SIM/NL-SIM)）及其衍生“非线性SIM”（NL-SIM）、“随机光学重构显微技术”（STochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM）、“（荧光）光敏定位显微技术”（(fluorescent) Photo-Activated Localization Microscopy, (f)PALM）、“点积累在纳米尺度的地形成像技术”（DNA - Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography，(DNA)PAINT）、“超高分辨光学涨落成像技术”（Super-resolution Optical Fluctuation Imaging，SOFI）以及“光漂白和光闪烁的贝叶斯分析技术”（Bayesian analysis of Bleaching and Blinking，3B）等，加之近些年新出现的“最小光子流量成像技术”（nanoscopy with minimal photon fluxes，MINFLUX）、“离散分子成像技术”（Discrete Molecular Imaging，DMI）和“膨胀显微技术”（expansion microscopy, ExM）等，它们通过对标记分子物理原理，化学机制亦或是样品尺寸的研究和改造，成功地“越过”了这一衍射极限。科学家们得以用前所未有的视角观察奇妙的生物微观世界，并带来了瞩目的生物学研究成果。
2018年8月31日，作为STORM超分辨显微技术的发明创始人，哈佛大学庄小威（Xiaowei ZHUANG）教授在Science杂志的特刊Science Special Section“技术改变生物”（图1左）上以通讯作者身份发表了题为Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy的综述文章【1】（图1右），总结了以上提到的超分辨显微成像技术，并详尽地梳理了自问世以来，超分辨显微技术在观察和发现新的细胞结构、功能方面的卓越贡献。
图1 《科学》杂志特刊及庄小威教授发表的综述文章【1】
通常来说，现有的超高分辨显微技术被分为两大类，以STED和SIM为代表的“基于点扩散函数修饰”和“结构光照明”，还有以STORM/PALM为代表的“基于单分子荧光定位”的超分辨技术（图2）。
第一大类中，STED及其衍生RESOLFT都是利用“甜甜圈”状的空心光束来修饰位于中间激发光的PSF，从而达到直接超分辨成像的目的。不同的是STED利用了荧光染料分子的“受激辐射损耗”性质，RESOLFT利用了荧光蛋白的“光控可逆转化”（photo-reversible）性质。而(s)SIM则是利用了包含样本的结构信息的干涉图案“摩尔条纹”照明方式，加上后期的图像重构，达到超分辨成像的目的，此外，通过引入非线性光学，NL-SIM可以达到更高的分辨率。
第二大类中，STORM和PALM都是利用了荧光染料分子“光控开关”（photo-switchable）或者荧光蛋白的“光控转化”（photo-convertible）性质，达到在一个衍射极限空间内（200~300 nm）随机“点亮”单个荧光分子并进行高精度定位的目的。类似地，PAINT技术利用了对化学反应常数的精确调控，从而达到类似的“点亮”效果（带有荧光标记的分子和靶向分子之间的短暂结合）。
除上述两大类之外，新兴的MINFLUX技术【2】综合了两类成像技术的优点，将定位精度提高到了前所未有的1纳米；膨胀显微技术ExM【3】通过直接将被成像样品进行物理膨胀的手段，间接达到超分辨成像的目的。此外，还有基于荧光信号的涨落，如闪烁（blinking）和漂白（bleaching）的SOFI和3B技术，他们的出现进一步丰富了超高分辨率显微技术的选择和应用。感兴趣的读者可以从下面三篇综述文章中获取更多信息【4-6】。
图2 两大类超高分辨显微技术，基于单分子定位的STORM/PALM，基于点扩散函数修饰的STED/RESOLFT【7】
02超高分辨显微技术有多厉害？
技能一：三维解析能力
2.1
三维解析能力对于超分辨成像技术在生物样品中的应用甚是重要。值得一提的是，“基于单分子定位”的超分辨成像技术借鉴了很多天文学研究的算法，Z轴分辨就是其中一个：通过在成像光路中引入一个柱面透镜达到对点扩散函数的修饰，从而实现三维成像，但Z轴较XY平面分辨率稍差。此外，还有双焦面成像，PSF工程改造和干涉等方法来实现超分辨显微技术的三维解析能力。在STED和RESOLFT中，通过双物镜产生相互抵消的“甜甜圈”照明实现了各向同性的三维超分辨解析能力。
技能二：空间分辨率能力
2.2
超分辨成像技术的重中之重，当然是分辨率的提升。理论上，不论是基于结构光照明的STED，RESOLFT和NL-SIM，还是基于单分子定位的STORM和PALM，都是不受衍射极限约束的，所以他们的理论分辨率是无穷小【1】。但是，在实际的生物样品拍摄中，分辨率受到很多因素的影响，例如激发光的效率，探测器的灵敏度，标记物的光物理性质及其物理大小，标记效率和密度等因素，当然还有生物样品本身的散射和吸收问题。在实际的生物样品拍摄中，这些技术通常能达到10-70纳米的分辨率，少数情况下可以达到小于10纳米的分辨率（比如双物镜STORM，基于DNA-PAINT的DMI和MINFLUX技术等）。
下表简单总结了几种主流超分辨技术的原理、三维成像能力、分辨率和荧光基团要求（总结并不完全，欢迎指正、补充）。
表1 主流超分辨显微成像技术参数总结【1, 4, 6】
对于较厚的生物样品，为了解决散射的问题，近些年发展的适应光学系统（Adaptive Optics, AO），光片照明技术（Light-Sheet Illumination），组织透明化处理（Tissue Clearing）和物理切片等技术方法也取得了可喜的成果。
技能三：活细胞成像，时间分辨率和光毒性
2.3
对于STED，RESOLFT和SIM来说，活细胞成像、时间分辨率都是其技术优势，STED和RESOLFT在较小的视场下可以达到很高的时间分辨率（<50ms），较大视场下也可以达到秒以下的视频采集率。由于MINFLUX成像对于光子的要求更低，其时间分辨率可以达到100 μs。但是，对于“基于单分子定位”的STORM，PALM和PAINT来说，时间分辨率相对来说是其技术短板（通常一张不错的STORM图像需要20~30分钟的采集时间），时间和空间之间的权衡是关键。开发和利用较快“开关”的荧光基团，搭配速度更快的探测器，更高数值孔径的物镜，可以实现时间分辨率的提升。
此外，在兼顾空间和时间分辨率的同时，还要考虑高激发功率照明下对于生物样品的光毒性，尤其是STED中较高的“擦除”光和STORM中的“打灭”光。值得一提的是，2018年发表的几项技术都实现了超低激发功率下的超分辨成像：例如结合适应光学的“栅格层状光显微术”【8】（Adaptive Optics Lattice Light Sheet Microscopy，AO-LLSM），结合更高数值孔径物镜和新算法的“海森SIM”【9】（Hessian-SIM），以及“近红外发射饱和显微技术”【10】（Near-Infrared Emission Saturation Nanoscopy， NIRES）等，具体细节不做赘述。
如图3（原文图1）所示，这篇综述详尽地总结了超分辨显微成像技术在发现细胞内新结构、生物分子相互作用，定量分子计数，和动态时间跟踪方面的应用。图示中给出了基本信息，具体细节在此不做赘述。
图3 超分辨显微技术的三个主要应用方向及其定量生物学结论【1】
(A) 细胞结构的空间分布和分子相互作用。
(i) STED解析病毒包膜蛋白Env和HIV-1受体CD4的空间关系。(ii)PALM解析ESCRT-I亚基Tsg101和HIV Gag蛋白共定位。 (iii) 3D STORM 解析精子特有钙离子通道CatSper1的四通道三维结构。 (iv) PALM解析细菌中ParA和ParB蛋白的极性分布。 (v) 左：栅格层状光显微术展示PAINT标记的ER，右：三维PAINT图像。 (vi) STED解析细胞死亡mediator Bax蛋白的环状结构和线粒体Tom20的关系。 (vii) STORM解析线粒体和嘌呤体核心蛋白FGAMS的相互作用。 (viii) STORM对比解析小鼠胚胎细胞中的端粒DNA在TRF2有或无的情况下的图像。 (ix) STORM对比解析“激活的”“非激活的”和“抑制的”染色质域。
(B) 生物分子复合体的计量学。
(i) PALM定量解析细胞膜上的原癌基因cRAF团簇。 (ii) 3D PALM定量解析细菌细胞中不同大小的PrgH分子团簇。 (iii) STORM定量解析内吞小泡上的PI3P结合位点。
(C) 细胞结构的动态学。
(i) STED-FCS和共定位显微镜解析三种磷脂PE，SM和SM Coase在~20nm纳米域中的受限时间。 (ii) MINFLUX单分子追踪细菌中的30S核糖体亚基蛋白。 (iii) STED时间解析EGFP标记的小鼠躯体感觉皮质神经细胞。 (iv) 动态STORM解析线粒体分裂和融合事件。
在这里要详细介绍的是三个用超分辨成像技术解析的分子组装的例子：i) 神经细胞中的膜相关周期性骨架，ii) 神经突触的分子构成和 iii) 结构对称性的蛋白复合体。
神经细胞中的膜相关周期性骨架
4.1
作为庄小威教授的经典工作之一【11】（也是庄小威教授每次会议报告致谢页面的背景），如图4A（原文图2A）所示，STORM被用于解析神经细胞中的膜相关周期性骨架（Membrane-associated Periodic Skeleton，MPS）结构。2D和3D STORM图像向我们清晰地展示了一个由短Actin纤维和成帽蛋白Adducin形成的空间重复出现的环状结构缠绕着的神经轴突。临近的actin环状结构由Spectrin连接，并且形成了间距为180~190 纳米的周期排布【11】。同样地，如图4B和C所示，在郎飞(Ranvier)结区，树突结构中也存在着类似的周期性骨架结构；如图4D所示，在神经元胞体上发现了类似栅格状的周期排布的Spectrin蛋白，细节在此不做赘述。
图4 超分辨显微技术用于解析神经细胞（轴突，郎飞结区，树突和胞体）中的膜相关周期性骨架（Membrane-associated Periodic Skeleton，MPS）【1】
神经突触的分子构成
4.2
神经突触的物理大小通常只有几百纳米，传统光学显微镜限于分辨率，需要超分辨成像技术来揭示其中的精细结构。如图5A~D（原文图3A~D）所示，STED、STORM和PALM都被用来解析神经突触及其间隙蛋白的三维精细结构、特定分子分布或定量关系。值得一提的是，近期的超分辨工作将神经突触成像推向了大体积、蛋白质组学的高度。经典的工作由庄小威教授于2015年发表于Cell，如图5E（原文图3E）建立了一个具有自动分割、多色标记、大体积能力的STORM成像平台，对2.3×105μm3的小鼠视网膜On-Off direction-selective ganglion cells (On-Off DSGCs)细胞神经元及其突触进行了多色超高分辨成像和定量分析【12】。
图5 超分辨成像技术用于解析突触精细结构、分子分布和定量关系【1】
结构对称性的蛋白复合体
4.3
如图6（原文图4）所示，类似于电子显微镜中的颗粒平均（particle averaging）技术，超分辨显微技术如STED、SIM、STORM也被用于解析结构对称性的蛋白复合体。其中，中心粒（centrioles）的经典9+2结构和核孔复合物的经典八重结构就是两个极佳的例子。通过对特异蛋白的荧光标记，实现了对中心粒和核孔复合物的分子精确定位及结构解析。
图6 超分辨显微技术用于解析中心粒（九重对称结构）和和孔复合物（八重对称结构）【1】
05超高分辨显微技术的未来展望
自2006年问世以来，以STED、SIM、STORM和PALM及其衍生为代表的超分辨显微成像技术被广泛应用到对于生物系统新结构和新功能的探索中，但经历了十余年的发展，其技术瓶颈依旧存在。虽然这些成像技术的理论分辨率都没有限制，但是在真实的生物样品拍摄过程中，通常只能达到10~70纳米分辨率。这个分辨率距离真实分子的大小（~1纳米）还有一定的差距，对于真正解析单分子结构或分子间相互作用还远远不够。实际操作上，第一类技术主要受限于激发光、擦除光强度造成的光漂白和光毒性，第二类则受限于荧光标记物的光子产率、on-off效率等。通过整合两类技术的优势，MINFLUX技术【2】达到了1纳米分辨率；组织透明化技术、ExM技术【3】通过直接改变样品的物理性质巧妙地增加了空间分辨率。
展望未来，单分子及超高分辨率显微成像技术的发展趋势应该是满足生物、材料和医学成像中三维、活体和快速成像的需求，即获得更高的空间和更快的时间分辨率以满足更小尺度更快生物过程的研究，以及需要得到更深的成像深度以满组织和个体的成像需求。应当从以下几个方面入手改进：
① 发展新的超分辨硬件技术
例如更高输出功率的激光器、更低光损耗的透镜光学组件、更稳定的光学系统、更快的扫描元件、更高数值孔径且工作距离更长的显微镜物镜、更快更灵敏的单光子探测器、更智能的自适应光学系统等。
② 开发和优化新的探针及其标记方法
对荧光蛋白和染料做结构分析、改造，提高荧光蛋白和有机染料的亮度、光稳定性、光激活、光转化、光开关特性以及转换速率等特性；开发新型的有机、无机探针，如金颗粒、半导体量子点、聚合物量子点、上转换纳米颗粒等；提高探针的标记特异性、降低非特异性结合也是提高分辨率的努力方向。
③ 发展多模态融合
将基于荧光的超高分辨率成像技术与基于粒子的电子显微镜结合，发挥二者各自互补的优势，实现电子显微镜和光学显微镜各自的优势，即超高分辨率和分子特异性的完美结合即“光电联合显微技术”（correlative light & electron microscopy，CLEM）。
④ 开发新的数据处理算法
面对三维大尺度（例如整个神经元，整个脑组织）的成像，以及4D基因组成像的需求，我们将面临TB级别数据的处理，大数据时代需要更加高效的图像处理算法和软件，此外，对于超分辨数据深度挖掘也是未来发展的方向之一。
孙育杰研究员现为北京大学大学生命科学学院PI，国家基金委杰出青年获得者，中组部第一批青年千人。孙育杰实验室主要研究兴趣为（1）发展单分子、超分辨显微成像和活细胞成像技术（2）研究哺乳动物细胞染色质的高级结构及其动力学过程（3）研究染色质结构如何参与调控DNA复制和转录过程。近年连续以通讯作者身份在Science，Nature Communication，Advance Material，Developmental Cell，Cell Research，ACS Nano等杂志上发表多篇研究论文。
参考文献
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8. Liu, T.L., et al., Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms. Science, 2018. 360(6386).
9. Huang, X., et al., Fast, long-term, super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy. Nat Biotechnol, 2018.
10. Chen, C., et al., Multi-photon near-infrared emission saturation nanoscopy using upconversion nanoparticles. Nat Commun, 2018. 9(1): p. 3290.
11. Xu, K., G. Zhong, and X. Zhuang, Actin, spectrin, and associated proteins form a periodic cytoskeletal structure in axons. Science, 2013. 339(6118): p. 452-6.
12. Sigal, Y.M., et al., Mapping Synaptic Input Fields of Neurons with Super-Resolution Imaging. Cell, 2015. 163(2): p. 493-505.
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