专家解读Cell丨基因表达调控研究进入新阶段“Phase”

BioArt按

最近一段时间，有关“相变”或“相分离”（Phase separation）的文章不断地出现在CNS杂志上（详见BioArt过去的报道：李丕龙教授特评丨生物大分子的“相变”——简谈近期系列“相变”研究成果；学者笔谈丨漫谈“相分离”）。围绕相分离与转录调控，过去也有一些研究，最近周强研究组的工作揭示了相分离对基因转录调控的分子机制（Nature丨相分离对基因转录调控的分子机制——刚柔并济的分子调节及药物开发新理论）。此外，2017年MIT的Phillip Sharp和Richard Young等在Cell上发表观点性文章，提出了一个以相分离理论解释超级增强子参与基因调控的模型，但没有直接的实验证据。今年6月份，Richard Young组在Science上发表研究长文为超级增强子通过相分离调控基因表达的模型提供了实验证据（Science亮点丨超级增强子通过相分离调控基因表达）。近日，Richard Young组在Cell上再次发表相分离与转录调控相关的文章，为了让读者更好的了解Richard Young组的这项重要工作，BioArt特别邀请到了北京大学生命科学学院季雄研究组对该工作进行了解读，以飨读者！

图片引自：https://www.nyas.org/events/2019/

解读丨段文嘉、周蓉、季雄（北京大学生命科学学院）

责编丨迦溆

在经典的生物化学中，蛋白质的结构决定了功能，蛋白质通过结构域之间类似钥匙和锁的相互作用组装成大分子机器，执行丰富多彩的生命活动。转录因子是由含有特定结构的DNA结合结构域（DNA Binding Domain, DBD）和无定形结构的转录激活结构域（Transactivation Domain, TAD）组成的蛋白质，它与表观调控因子一起决定了不同的细胞命运。转录因子的转录激活结构域没有固定的结构，很难用经典生物化学中的理论推测其功能。细胞中的转录因子已经发现的有数百种，它们都可以与同一种转录中介体复合物Mediator相互作用激活基因表达，这也很难用经典的锁-钥模型解释。

2018年6月MIT的Richard Young组在Science杂志上发表文章，发现转录中介体复合物Mediator亚基MED1和表观调控因子BRD4在超级增强子（Super-Enhancer）处发生液-液相分离，阐述了一种共转录激活因子通过相分离参与基因表达调控的新颖机制，详见本实验室此前发表在BioArt上的解读：Science亮点丨超级增强子通过相分离调控基因表达【1】，这项研究为超级增强子通过相分离调控基因表达的模型提供了实验证据，也对细胞命运决定和疾病发生过程中关键基因的表达调控过程提供了全新的视角和概念。

近日Richard Young组在Cell杂志上发表了题为Transcription Factors Activate Genes through the Phase-Separation Capacity of Their Activation Domains的文章【2】，报道了转录因子OCT4和GCN4的转录激活结构域通过与转录中介体复合物Mediator发生液-液相分离激活基因表达，这项研究为我们进一步理解数百种其它的转录因子的功能机理，以及发育和疾病过程中基因表达调控机制提供了新思路。

OCT4是胚胎干细胞特异性的转录因子，两端是无序的转录激活结构域负责基因激活，中间是具有固定结构的DNA结合结构域。OCT4可以与转录中介体复合物Mediator的亚基MED1相互作用在胚胎干细胞的超级增强子处形成蛋白凝聚体。新生RNA荧光原位杂交（FISH）结合免疫荧光（IF）实验显示，在干性基因Esrrb、Nanog、Trim28和Mir290的超级增强子附近存在离散的OCT4蛋白斑点（下图），ChIP-seq结果显示OCT4和MED1定位于超级增强子附近（下图左）。

作者以Nanog基因为例，发现当使用dTAG 系统瞬时降解mES细胞中的OCT4蛋白，原先在超级增强子附近的MED1和OCT4都显著降低，Nanog基因的表达也随之降低。另外作者发现在胚胎干细胞的分化过程中，随着Mir290基因超级增强子附近的OCT4的丢失，该处共定位的MED1显著降低，Mir290的表达也显著降低。所以转录中介体复合物Mediator的亚基MED1在胚胎干细胞超级增强子处的聚集依赖转录因子OCT4。

图片引自：Molecular Biology of the Cell, 6th Edition, Bruce Alberts; Boija et al., Cell 2018

转录因子OCT4的没有固定结构的转录激活结构域通过与转录中介体复合物Mediator的亚基MED1的无序区域（Intrinsic Disorder Region, IDR）发生液-液相分离从而激活基因表达。接下来作者为了探究OCT4自身能不能发生聚集，以及OCT4发生聚集的能力是否受到MED1的影响进行了一系列的体外实验，结果表明OCT4-GFP蛋白单独在整个测试浓度范围内都不形成液滴（下图）。

然而MED1-IDR-GFP蛋白表现出浓度依赖性的液-液相分离（上图），当将两种蛋白混合时，OCT4-GFP蛋白可以被招募进入MED1-IDR-GFP液滴中，并显示出液滴的性质，例如对盐离子浓度敏感、液-液融合和荧光漂白恢复（FRAP）（下图）。

作者对OCT4 转录激活结构域氨基酸丰度和电荷偏好性分析发现，OCT4 转录激活结构域区富含脯氨酸和甘氨酸及带负电的酸性氨基酸。作者体外分别合成了荧光标记的富含脯氨酸和谷氨酸的十肽，发现谷氨酸肽可以被招募进MED1-IDR-GFP液滴中，而脯氨酸肽不能掺入MED1-IDR液滴中。这些结果表明，具有酸性氨基酸基序的多肽容易进入MED1液滴中。

接下来作者将OCT4两端转录激活结构域中的所有酸性残基突变为丙氨酸后，发现被招募入MED1-IDR液滴的OCT4显著降低，而当所有的芳香族氨基酸突变却没有此现象。此外，体外纯化的转录中介体复合物Mediator与 MED1-IDR类似也能和OCT4发生液-液相分离。

这些结果表明，MED1-IDR和完整的转录中介体复合物Mediator各自都能在体外发生液-液相分离，它们招募OCT4依赖于转录激活结构域的酸性氨基酸提供的静电相互作用。另外作者将OCT4 转录激活结构域融合到GAL4 的DNA结合结构域，利用荧光素酶报告系统，发现野生型OCT4可以激活基因表达，但突变型却不能。这些结果表明，OCT4 转录激活结构域的酸性氨基酸基序对于其进入MED1的液滴以及基因激活功能都是必需的。由此推知，OCT4的转录激活结构域是通过与MED1聚集形成液滴发挥其基因激活功能。

多种转录因子可以和转录中介体复合物Mediator的亚基MED1发生液液相分离从而激活基因表达。为了探究其它转录因子是否和OCT4一样，可以通过与转录中介体复合物亚基MED1发生液-液相分离，作者在体外纯化了多种带mEGFP标签的转录因子，例如MYC、p53、NANOG、SOX2、RARa、GATA2和ER，它们有的可以单独在体外形成液滴（下图），但所有检测的转录因子都可以被招募进入MED1-IDR液滴中，所以转录中介体复合物Mediator相互作用的其它转录因子也能和MED1发生液-液相分离。

ER是经典的配体依赖性转录因子，ER 由N端配体非依赖性转录激活结构域、中间的DNA结合结构域和C端配体依赖性转录激活结构域组成。之前研究表明雌激素通过结合ER，导致ER的构象发生变化，促进ER与MED1的相互作用（下图），进而暴露了MED1-IDR内LXXLL基序的结合口袋激活基因表达。

为了探究雌激素是否参与ER和MED1的相分离以及LXXLL基序是否在其中发挥作用，作者进行了体外实验发现MED1-IDRXL单独可以形成液滴，ER可以被招募进入MED1-IDRXL液滴，加入雌激素可以增加ER进入MED1-IDRXL液滴，但是不能促进ER进入MED1-IDR液滴。因此，雌激素能促进ER与MED1形成液-液相分离，激活ER介导的基因表达依赖于LXXLL基序。

作者进一步纯化了GCN4-GFP和MED15-mCherry蛋白，它们单独可以形成液滴也可以一起形成液滴，这些液滴的形成依赖于GCN4疏水区的11个芳香族氨基酸与MED15的无序结构域间的弱相互作用。作者在U2OS细胞中将GCN4的转录激活结构域锚定在LacO序列上，可以观察到显著的Mediator复合物的聚集，但其突变体却不能。另外荧光素酶实验表明GCN4的转录激活结构域可以激活细胞内的基因表达，但其突变体不能。综上，多种转录因子可以和转录中介体复合物Mediator发生液液相分离从而激活基因表达。

基因表达调控研究进入一个新的阶段“Phase”。图片引自：Cell，2018

这项研究提出了转录因子的转录激活结构域通过与转录中介体复合物Mediator发生液-液相分离来激活基因表达的模型。这一模型对于我们理解疾病过程中由于染色体异位，某些转录因子的DNA结合结构域与其它无序蛋白结构域融合产生突变蛋白的致病机理提供了理论基础。进一步解析基因表达调控中的相分离密码和调控机理对于疾病的治疗也许可以提供崭新的途径。

参考文献

1. Sabari, B.R., et al., Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science, 2018.

2. Boija, Ann, et al. Transcription Factors Activate Genes through the Phase-Separation Capacity of Their Activation Domains. Cell (2018).

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