Cell详解 | 奖赏动机限制如何受控制？
撰文 | 陈文强（哈佛医学院张毅组博后）
责编 | 兮
大脑奖赏寻求 (reward seeking) 环路受机体稳态平衡状态和奖赏可获取性的调节。当奖赏资源贫乏时，动物奖赏寻求的动机会大幅降低，而对不确定奖赏的持续病态寻求会使得动物暴露于天敌和体能耗竭的风险大大增加。
庆幸的是，大脑存在精准的神经调控机制来限制异常的奖赏寻求行为。对人类而言，这种神经调控机制的障碍与抑郁症、药物成瘾等多种神经精神疾病密切相关，不仅给个人的身心健康带来危害，更严重威胁社会安定，甚至引起酒精与毒品滥用等重大社会安全问题【1】。因此，寻找大脑奖赏寻求的环路机制具有重大意义。
近年来，由于神经环路解析技术特别是清醒自由活动小动物钙成像技术的突破，允许神经生物学家可以从多重水平寻找调节大脑奖赏寻求环路的机制，如2017年斯坦福大学Deisseroth组在Cell上揭示了由前额叶皮层至伏隔核的投射介导的自上而下 (top-down) 的奖赏机制【2】。同年， 北卡罗来纳大学教堂山分校的Stuber组发表的一篇Nature工作揭示了前额叶皮层分别至伏隔核、丘脑室旁核的投射介导奖赏寻求的不同方面【3】，其中，投射至室旁核的前额叶皮层神经元主要能抑制奖赏寻求的条件性获取过程。尽管大部分关于奖赏寻求的研究揭示前额叶皮层对皮层下结构的输出支配起着重要作用，但最后信息均需要传递至奖赏中心中脑腹侧被盖区 (VTA) 进行进一步加工处理。由于研究手段的限制，过去普遍认为VTA多巴胺 (DA) 神经元在生物特性及功能上是相同的，直到近几年研究人员才逐渐发现，VTA DA神经元在分子功能、环路联系及行为效应方面的复杂性超乎想象。因此，我们亟需对VTA DA神经元的异质性 (heterogeneity) 从不同水平进行更深一步的研究。Morales教授于2017年在Nature Reviews Neuroscience杂志撰写的综述文章对此有详尽阐述，读者若感兴趣，可进一步详尽阅读【4】。
越来越多的证据表明，VTA DA神经元的活动直接受局部或伏隔核的抑制性神经元 (GABAergic neuron) 的强有力控制，而VTA 局部的抑制性神经元也可以对VTA DA神经元的活动性进行调控。这群局部的VTA抑制性神经元可根据其表达分子标记物或释放的神经递质进一步分为多个亚群，特别是多种抑制性神经元共释放神经肽【4】。神经肽系统如何直接或间接调控DA神经元的生理活动及功能，特别是神经肽如何通过VTA DA系统调控动机行为及奖赏寻求行为，我们仍知之甚少。
2019年7月25日，来自美国华盛顿大学西雅图分校的Michale Bruchas研究组在Cell杂志在线发表了题为A Paranigral VTA Nociceptin Circuit that Constrains Motivation for Reward的研究论文，通过构建中脑腹侧被盖区(VTA)黑质旁核(paranigral nucleus)特异前原孤啡肽(Pnoc)的工具小鼠（Pnoc-Cre），通过一系列完整、逻辑严密的功能验证研究，揭示了这类神经元亚群能特异调控奖赏寻求行为。该研究对进一步揭示药物成瘾中特征的觅药(drug seeking)行为的机制具有重要意义。
一般情况下，若需对大脑某类特定神经元亚群进行功能鉴定，我们需要了解
（1）其解剖学输入及输出联系 (Cell文中图1) ，
（2）在某个行为范式中的神经元活动性相关性 (图2及图3) ，
（3）该亚群的分子表达特征 (图4) ，
（4）随后再进行该神经元活动性的操控研究（选择性损毁及抑制、选择性激活，图5-图6）等。
研究人员首先构建了Pnoc-IRES-Cre敲入小鼠，随后将该小鼠与多种报告工具小鼠杂交，从而对Pnoc神经元的全脑定位及轴突顺行投射进行了研究，随后通过两种逆行示踪方法对VTA特定表达Pnoc的神经元的投射进行了验证。首先，为研究VTA特定表达Pnoc的神经元是否与VTA DA神经元存在解剖学联系，研究人员使用DAT-cre小鼠及狂犬病毒工具进行了DA神经元的单突触逆行示踪研究，意外发现VTA腹侧的黑质旁核能直接投射至DA神经元。随后，研究人员使用逆行AAV病毒进一步验证了该直接联系。因此，病毒示踪提示，VTA黑质旁核特定表达Pnoc的神经元能直接支配VTA的DA神经元。
基于解剖学证据，研究人员使用光纤记录技术进一步检测了该神经元是否能直接参与奖赏寻求行为。研究人员训练小鼠进行操作训练 (operant task) ，在该行为范式中，小鼠需以特定固定比率 (fixed ratio, FR) 及渐进比率 (progressive ratio, PR) 训练程序，鼻触有效孔获得蔗糖奖赏。该行为范式也属于经典条件反射操作，为完成该行为操作训练，小鼠需对训练箱灯光线索与奖赏建立关联。
光纤记录实验发现，Pnoc神经元的活动性在小鼠进行FR3及PR鼻触程序时会显著升高，更进一步的分析发现，在PR鼻触程序早期 (即奖赏可持续获得时) ，Pnoc神经元的活动性较低，随后随着训练难度的加大 (如FR3及PR程序) ，尤其在小鼠达到最终鼻触阶段断点 (breakpoint) 并将终止奖赏寻求行为时，Pnoc神经元的活动性达到最大。而当奖赏寻求行为终止后的数秒内，神经元活动性可降至基线值。这部分研究提示，VTA的Pnoc神经元既参与奖赏寻求，其活动性还与奖赏价值呈负相关。
光纤记录意外发现，VTA Pnoc神经元在同一操作训练范式的活动性改变具有明显差异。我们知道，VTA解剖学结构复杂，此前有学者撰写综述总结到，VTA存在前后轴的结构异质性 (antero-posterior heterogeneity) 【5】。研究人员对光纤插入位置与Pnoc神经元活动性进行了关联分析，发现前侧VTA (AP -3.5 mm之前) 内记录到的神经元活动性在FR3和PR程序中升高，而在后侧VTA (AP -3.5 mm之后)则降低，而这一差异仅在奖赏消耗 (reward consumption) 阶段存在。研究人员随后使用经典条件反射范式分析线索与神经元活动性关联，发现这群VTA黑质旁核Pnoc神经元仅响应于限制奖赏寻求行为，而并不参与奖赏预测失误的编码。
研究人员对VTA黑质旁核Pnoc神经元对VTA多巴胺能神经元的单突触输入进行全细胞电生理记录发现，抑制性突触后电流可被GABAA受体拮抗剂Gabazine特异性阻断，提示GABA系统在VTA黑质旁核Pnoc神经元内可能具有作用。基于此，研究人员更进一步使用翻译核糖体亲和纯化 (TRAP) 技术对于该细胞亚群的转录水平进行了研究，发现该群细胞同时表达vGLUT2和vGAT基因，提示谷氨酸和GABA共存。使用原位杂交对前后侧VTA黑质旁核的vGLUT2和vGAT基因与Pnoc共定位分析后发现，前侧VTA黑质旁核主要表达vGLUT2，而VGAT的表达在后侧逐渐增多，进一步提示VTA黑质旁核Pnoc神经元在前后侧分别代表两群在解剖学定位和转录组特征上代表着两群显著不同但又有所重叠的细胞亚群。
为研究VTA黑质旁核Pnoc神经元在自然奖赏寻求中是否具有必要性，研究人员使用了三种策略来观察特异损毁 (ablation) 或抑制Pnoc神经元是否能影响对奖赏动机。首先，研究人员使用病毒工具特异性在Pnoc神经元内诱导凋亡，发现与对照组相比，损毁小鼠在PR程序中表现出明显增加的鼻触次数、奖赏获得量及操作响应次数。代表着奖赏动机强度的断点数也显著增加，因此确认了黑质旁核Pnoc神经元在限制奖赏动机的必要性。
然而，细胞特异损毁实验能带来不可逆的神经元凋亡，那么对这群细胞的可逆抑制能否观察到同样的效应？研究人员使用化学遗传及光遗传方法，在Pnoc神经元内特异性表达抑制性元件hM4D或eNpHR3.0，发现外源性配体CNO或是光刺激均能显著增加断点及奖赏获得量。这些实验提示VTA黑质旁核Pnoc神经元仅对奖赏的操作响应而非奖赏消耗行为具有必要性，再次证明了这些神经元调节奖赏寻求行为。
为反向验证VTA黑质旁核Pnoc神经元在调控奖赏寻求的充分性，研究人员再次使用化学遗传及光遗传学技术。首先，研究人员在Pnoc神经元内特异性表达兴奋性光杆元件ChR2，随后在操作训练范式中进行5Hz、60分钟的光刺激该神经元胞体及轴突末端，发现能显著降低FR3及PR程序中的总鼻触次数及奖赏获得量。同时，选择性孤啡肽受体拮抗剂J-113397的腹腔注射可防止光遗传激活诱导的奖赏寻求行为的降低，进一步佐证了该调控机制的细胞类型特异性。
化学遗传介导的神经元激活实验同样观察到了类似的现象。在VTA黑质旁核Pnoc神经元特异性表达兴奋性元件hM3D的动物中，外源性注射CNO同样能降低PR程序中的鼻触次数与奖赏获得量，这种降低同样能被腹腔注射J-113397所预防。因此，CNO诱导的PR反应的降低进一步提示刺激VTA黑质旁核Pnoc神经元可能会释放孤啡肽来作用于孤啡肽受体。
至此，这一系列细胞类型特异性的神经元活动性操控实验已经提示了孤啡肽-孤啡肽受体系统可能介导奖赏寻求动机的限制，然而，另一个悬而未决的问题是，孤啡肽系统如何介导奖赏寻求限制，其作用靶点的机制是什么？为回答这个问题，研究人员使用孤啡肽受体敲除 (NOPR-KO) 小鼠鉴定了VTA孤啡肽受体表达对于奖赏寻求限制的充分性及必要性。首先，为验证充分性，研究人员腹腔注射选择性NOPR受体激动剂SCH-221510，发现能显著降低NOPR-KO小鼠鼻触次数及奖赏获得量，提示外源性孤啡肽受体激活能充分降低对奖赏断点(既动机强烈程度)。随后研究人员对VTA多巴胺能神经元进行光纤记录实验，并结合药理学工具药手段对孤啡肽受体分别操控，同样发现，选择性孤啡肽受体激动剂或拮抗剂给药能双向改变多巴胺能神经元的活动性。
为验证孤啡肽受体表达的必要性，研究人员使用VTA孤啡肽受体的条件性敲除技术，可供脑区特异性及细胞类型特异性的选择性孤啡肽受体敲除。通过对比三种敲除方式——孤啡肽受体全身性敲除、VTA孤啡肽受体的条件性敲除，以及VTA多巴胺能神经元的孤啡肽受体的条件性敲除，研究人员均能发现小鼠在操控行为PR程序中的鼻触次数及奖赏获得量显著增加。
为验证孤啡肽受体表达的充分性，研究人员将孤啡肽受体敲除小鼠与Th-cre小鼠杂交，通过注射AAV病毒至VTA，将编码孤啡肽受体启动子的基因表达于多巴胺能神经元，因此重新将孤啡肽受体特异性表达在VTA多巴胺能神经元。后续操控行为实验发现，腹腔注射孤啡肽受体激动剂能显著降低PR程序的鼻触次数及奖赏获得量，提示内源性孤啡肽及孤啡肽受体活性对VTA多巴胺能神经元具有重要调控作用。
总之，本文通过构建Pnoc-cre小鼠，特异性标记并分离出VTA的Pnoc特异表达小鼠，从而发现了VTA黑质旁核的孤啡肽系统对于奖赏寻求行为的限制具有重要调控作用。其中，本文使用到了多种水平的技术，包括——
(1)神经环路：狂犬病毒单突触逆行示踪技术、retroAAV逆行示踪技术、顺行示踪；
(2) 神经元活动性记录：光纤记录钙成像技术及全细胞电生理记录；
(3) 解剖学与形态学：原位杂交、免疫荧光；
(4)分子生物学：翻译核糖体亲和纯化、转基因小鼠构建；
(5)神经元活动性操控：化学遗传学、光遗传学；
(6)药理学：工具药、受体条件性敲除及条件性表达；
(7)行为学：奖赏寻求行为、条件性位置偏好、实时位置偏好等。
除此以外，本文还多次进行充分性及必要性的双向验证，不仅激活与抑制神经元活动性，且进行了不同时程的神经元活动性操控——毫秒级的光遗传操控、可逆的min-hour级的化学遗传操控、以及长达数日的慢性损毁 (ablation) 实验，因此，总的说来，本文所使用的到的神经生物学技术不仅前沿，而且特别全面，笔者认为是一篇经典的研究特定脑区的特定神经元亚群的特定功能的佳作。结合笔者曾在张毅教授课题组分享的一篇Journal Club文章【6】，读者应该可以看到，很多优秀的研究都有着清晰严密的逻辑结构，从课题设计及讲故事上都有迹可循，非常值得学习和借鉴。
Credit：陈文强
人们对中脑腹侧被盖区多巴胺能神经元的研究仍然经久不息，不仅因为这群神经元具有高度异质性 (全脑广泛投射、表达丰富神经肽及受体系统) ，且参与广泛而关键的重要行为学功能。近期，华人学者在该领域取得的成就令人瞩目，如今年1月，浙江大学李晓明组在Neuron发文（Neuron专家点评丨李晓明组发现成瘾治疗的新通路靶点，未来或可有效缓解吗啡成瘾）【7】，报道了从中脑腹侧被盖区到中缝背核 (DRN) 的两条抑制性投射，其中，激活头端VTA和激活尾端VTA到DRN的抑制性投射能产生相反的行为学表型，分别介导吗啡成瘾的不同方面。而去年1月，加州大学伯克利分校Lammel组的杨鸿斌博士发表的一篇Neuron文章【8】，报道了外侧伏隔核及内侧伏隔核分别至外侧VTA及内侧VTA不同多巴胺能神经元亚群的两条平行投射，介导动机行为的不同方面。今年6月，哈佛医学院张毅组开发了基于病毒标记的VTA多巴胺能神经元细胞核捕获方法【9】，通过染色质可接近性的研究，鉴定出了调控中脑多巴胺能神经元基因表达的关键调控因子Gmeb1（详见BioArt报道：专家点评 | 张毅实验室神经生物学领域的开山之作，附论文背后的故事）。这些研究使得我们更加透彻地了解中脑腹侧被盖区多巴胺能神经元的转录特征、环路联系及功能行为的复杂性。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.06.034
制版人：珂
参考文献
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