Mol Cell | 何川团队揭示哺乳动物线粒体DNA中6mA修饰的存在和功能
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DNA 6mA修饰广泛存在于原核生物的基因组中，并在限制修饰系统中用来保护自身基因组免受外源DNA入侵【1】。2015年，何川、施扬、陈大华课题组分别在绿藻【2】、秀丽线虫【3】和果蝇【4】的基因组中发现了6mA修饰，首次研究了DNA 6mA修饰在真核生物中的调控作用。近年来，越来越多的证据表明6mA修饰在一些特定的哺乳动物基因组中可能存在并发挥潜在功能。但是，6mA在大多数哺乳动物基因组中的含量极低（和常见的5mC修饰存在很大数量及的差距），目前已是领域内基本共识【5】，甚至有些组彻底否定这个这修饰的存在，认为是实验过程中的污染所致【6，7】。但是围绕催化/去除DNA 6mA修饰的酶类目前仍然存在重大争议和分歧（详见此前BioArt的报道：Cell Research背靠背 | 李海涛、陈忠周团队分别发文揭示哺乳动物中DNA 6mA去甲基化酶ALKBH1的工作机制）。6mA的动态变化和功能的研究仍存在很多未解之处。
2020年3月16日，芝加哥大学的何川团队在Molecular Cell上发表文章N6-Deoxyadenosine Methylation in Mammalian Mitochondrial DNA，发现哺乳动物中的DNA 6mA修饰主要富集在线粒体DNA上（线粒体DNA修饰是总DNA修饰量的千倍以上），而线粒体以外的DNA修饰总量是极其低的（这一结论和2017年报道的工作相吻合【5】），揭示了线粒体DNA 6mA修饰在哺乳动物线粒体活性调控和应激反应中的重要功能。郝子洋和吴桐为本文的共同第一作者。
研究人员首先借助高效液相色谱-质谱，免疫荧光和dot blot实验发现6mA修饰在线粒体DNA中富集。作者在实验过程中发现，使用市售线粒体纯化试剂盒仅能从HepG2细胞中富集6倍线粒体DNA，在这种情况下得到的线粒体DNA中6mA/dA水平为20 ppm。为了更高程度的富集线粒体DNA，作者使用plasmid-safe DNase对这些DNA进行处理。这种DNase选择性切除线性DNA而不切除环状的线粒体DNA，使得线粒体DNA富集程度达到100倍。使用这种条件得到的线粒体DNA中6mA/dA含量高达400 ppm。作者接下来使用6mA ChIP-exo技术测定了6mA在HepG2线粒体DNA上的位置，并发现6mA存在于线粒体转录的启动子(promoter)和基因编码区。
METTL4和哺乳动物中mRNA m6A甲基化酶METTL3/METTL14同属MTA70甲基转移酶家族，并且和秀丽线虫中DNA 6mA甲基转移酶DAMT-1同源。因此，作者猜想METTL4可能是DNA 6mA甲基化酶（BioArt注：关于METTL4催化的底物是DNA还是RNA目前有多种说法，存在争议）。作者使用了两个分别识别METTL4的N端和C端的抗体进行免疫荧光实验，证实METTL4蛋白在HepG2细胞，HeLa细胞，以及小鼠肝脏、大脑、脂肪和睾丸组织中均有线粒体定位。Western blot实验进一步证实了METTL4蛋白在HepG2细胞线粒体中的富集。在HepG2细胞中敲低METTL4导致线粒体DNA中6mA的含量降低30%，而线粒体RNA上的m6A以及m6Am含量均没有明显变化。体外实验证实，METTL4蛋白在线粒体DNA上具有甲基化活性。6mA-IP qPCR实验发现，在细胞内敲低METTL4导致6mA-IP对含有6mA的线粒体DNA片段富集程度降低，而过表达METTL4导致6mA-IP对这些片段的富集程度升高。这些证据共同表明，METTL4具有催化线粒体DNA上6mA甲基化的能力。
作者接下来在HepG2细胞中研究了6mA对线粒体活性的影响。敲低METTL4导致线粒体在正常和应激状态下的活性均升高。METTL4敲低的细胞具有更高的OXPHOS complex III水平，ROS水平以及更高的线粒体膜电位。通过RNA-seq和RT-qPCR实验，作者发现敲低METTL4导致线粒体mRNA和rRNA水平上升，说明METTL4可能通过影响线粒体转录水平影响线粒体活性。在敲低METTL4的细胞中回补野生型METTL4蛋白导致线粒体mRNA和rRNA水平降低，而回补突变失活的METTL4不会导致此效应，说明METTL4通过其6mA甲基化酶活性抑制线粒体转录。
为了阐释线粒体DNA 6mA抑制线粒体转录的分子机制，作者使用启动子上含有6mA修饰的线粒体DNA为模板进行体外转录实验。作者发现，重链启动子(HSP)上的6mA修饰使得线粒体转录下降60%，轻链启动子(LSP)上的6mA修饰使得线粒体转录下降30%。体外免疫沉淀实验，EMSA实验和FRET实验表明，HSP上的6mA抑制线粒体转录因子(TFAM)对DNA的结合和弯曲，而6mA对TFAM与LSP DNA的结合能力几乎没有影响。因此，线粒体DNA上的6mA修饰通过抑制TFAM对线粒体DNA的结合和弯曲，对线粒体转录起到抑制作用。
乏氧条件下，线粒体DNA上的6mA/dA含量升高至正常培养条件下的2.5倍，达到0.1%。METTL4含量也相应升高。敲低METTL4导致6mA含量下降70%。6mA ChIP-exo实验表明，乏氧条件下62%的6mA位点与正常条件下的位点重合。METTL4以及6mA在乏氧状态下的动态变化暗示了其可能作为细胞应激调节机制的一部分。
综上所述，该研究发现高丰度的6mA修饰广泛存在于哺乳动物的线粒体DNA中，并通过抑制TFAM对线粒体DNA的结合和弯曲抑制线粒体转录，从而调节线粒体功能。线粒体DNA 6mA含量受其甲基化酶METTL4调控，并在乏氧状态下显著升高。线粒体DNA上的修饰及其生物学功能一直广受关注，而以往的研究大多集中在5mC修饰。这项工作系统的研究了线粒体DNA上高含量6mA修饰的生物学功能，为未来相关领域的研究提供了新的思路。
作者在本文中还指出了6mA研究中的一些值得注意的问题。例如，测定6mA含量时应杜绝微生物（例如支原体）的污染（包括用于消化基因组的酶里面也有污染的风险，需要极其小心），测定线粒体DNA上6mA含量时应同时测定线粒体DNA的纯度等。这些建议为提高6mA研究的可靠性提供了重要的参考标准。
BioArt温馨提示：研究哺乳动物DNA 6mA修饰要非常谨慎，一不留神或许就被带偏了。后续仍然需要大量的研究厘清领域的本来面貌，可以先让子弹飞一会，好看的还在后面......BioArt后续会全面总结这个领域的发展史和各种争议，同时也会请相关专家发声，敬请读者关注！
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.02.018
参考文献
1. Wion, D., and Casadesus, J. (2006). N6-methyl-adenine: an epigenetic signal for DNA-protein interactions. Nat Rev Micro 4, 183-192.
2. Fu, Y., Luo, G.-Z., Chen, K., Deng, X., Yu, M., Han, D., Hao, Z., Liu, J., Lu, X., Doré, Louis C., et al. (2015). N6-Methyldeoxyadenosine marks active transcription start sites in Chlamydomonas. Cell 161, 879-892.
3. Greer, Eric L., Blanco, Mario A., Gu, L., Sendinc, E., Liu, J., Aristizábal-Corrales, D., Hsu, C.-H., Aravind, L., He, C., and Shi, Y. (2015). DNA Methylation on N6-Adenine in C. elegans. Cell 161, 868-878.
4. Zhang, G., Huang, H., Liu, D., Cheng, Y., Liu, X., Zhang, W., Yin, R., Zhang, D., Zhang, P., Liu, J., et al. (2015). N6-methyladenine DNA modification in Drosophila. Cell 161, 893-906.
5. Schiffers, S., Ebert, C., Rahimoff, R., Kosmatchev, O., Steinbacher, J., Bohne, A.-V., Spada, F., Michalakis, S., Nickelsen, J., Müller, M., et al. (2017). Quantitative LC–MS provides no evidence for m6dA or m4dC in the genome of mouse embryonic stem cells and tissues. Angew Chem Int Ed 56, 1268–11271.
7.Liu, B., Liu, X., Lai, W., & Wang, H. (2017). Metabolically generated stable isotope-labeled deoxynucleoside code for tracing DNA N6-methyladenine in human cells. Analytical chemistry, 89(11), 6202-6209.