『珍藏版』综述丨伊成器、宋春啸等全面总结DNA和RNA修饰的检测方法和研究困境
近日，北京大学的伊成器团队和牛津大学的宋春啸团队合作在Protein & Cell发表特邀综述“Mapping the epigenetic modifications of DNA and RNA”，该篇综述详细总结了目前高通量DNA/RNA修饰检测技术的方法和发现，包括应用三代测序在单碱基水平鉴定修饰位点，并讨论了该领域存在的问题和今后研究的方向。
DNA修饰在个体发育【1】、衰老【2】和癌症【3】中发挥了重要功能。这些修饰并不干扰Watson-Crick配对原则，但能影响蛋白与DNA的结合。在哺乳动物基因组中，胞嘧啶的第5位碳原子的甲基化（5-甲基胞嘧啶，5-methylcytosine或5mC）是丰度最高的DNA修饰类型，也被称为“第5种碱基”【1】。5mC由DNA甲基化酶DNMTs催化，主要富集在CpG岛。虽然5mC的分布具有组织特异性，但70-80%的CpG岛都具有5mC修饰【4】。5-羟甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine或5hmC），也被称为第6碱基，由TET1酶氧化5mC而来。5hmC的进一步氧化产生5-甲酰基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)。
与DNA类似，RNA也具有多种修饰，并且这些修饰参与了RNA代谢的各个方面。近年来利用高通量测序鉴定DNA/RNA修饰位点的技术极大地助力了表观基因组学和表观转录组学的研究。
1. 5mC的位点鉴定
重亚硫酸氢钠测序法（Bisulfite sequencing，BS-Seq）被认为是5mC鉴定的金标准，原理是重亚硫酸盐不影响甲基化C，却能将未发生甲基化的C转变成U（尿嘧啶），后者在PCR反应中变成T，并由此将甲基化C与未甲基化C区分开；再结合高通量测序技术，即可得到单碱基分辨率的全基因组5mC修饰图谱。重亚硫酸盐转换未甲基化C的效率高达99%，使得该方法的接受度最高【5-7】。然而，重亚硫酸盐处理会导致DNA的降解【8】，限制了它在稀少珍贵样品中的应用。另外，由于占基因组95%的未甲基化C转变成了T，降低了测序片段的匹配基因组的效率，也带来了覆盖度的偏好性。最后需要指出的是，BS-Seq并不能区分5mC和5hmC。
最近，两种无重亚硫酸盐的5mC鉴定方法被开发，分别是TAPS(TET-assisted pyridine borane sequencing)【9】和EM-seq（Enzymatic Methyl-Seq，EM-Seq）【10】，都利用TET酶对5mC的特异性氧化。TAPS的假阳性率比BS-Seq更低，能对少量DNA（1ng）进行检测；且配合过氧化氢钾可区分5mC和5hmC。EM-Seq利用了TET和DNA脱氨酶APOBEC3A，比BS-seq的灵敏度更高。
2. 5hmC，5fC和5caC的位点鉴定
深入了解5hmC、5fC和5caC的功能需要精确绘制其在基因组上的分布。oxBS-seq（Oxidative bisulfite sequencing）【11】和TAB-seq（TET-assisted bisulfite sequencing）【12，13】是改良的BS-seq，用于检测5hmC。hmC-CATCH（Chemical-assistant C-to-T conversion of 5hmC sequencing）【14】和ACE-Seq（APOBEC-coupled epigenetic sequencing【15】则是不依赖重亚硫酸盐的5hmC检测方法。5fC的检测方法包括fCAB-Seq（5fC chemically assisted bisulfite sequencing）【16】，redBS-Seq（reduced BS-Seq）【17】，MAB-Seq（methylase-assisted bisulfite sequencing）【18】和fC-CET（5fC cyclization-enabled C-to-T transition）【19】，CLEVERSeq（chemical-labeling- enabled C-to-T conversion sequencing）【20】（前三种方法是BS-seq的改良版，后两种方法则不依赖重亚硫酸盐）。5caC的检测主要采用CABSeq（Chemical modification-assisted bisulfite sequencing）【21】。值得注意的是，以上列举的测序技术都是基于化学的方法，将携带修饰或未被修饰的C转换为T，从而达到区分C是否携带修饰以及在单碱基水平鉴定DNA修饰位点的目的。
3. 基于抗体的DNA甲基化检测
基于抗体的DNA修饰位点鉴定是一种传统的，被广泛应用的较为简单的方法。目前5mC、5hmC、5fC、5caC均有商业化的抗体，可用于做DNA IP(DNA immunoprecipitation, DIP)。利用5hmC-DIP可鉴定癌症患者血液中循环DNA的5hmC【22】，说明此方法灵敏度高，无须耗费大量DNA，具有临床应用的潜力。但是DIP无法提供单碱基精度的DNA修饰分布位点，检测特异性非常依赖抗体本身的性质，且具背景（抗体与DNA的非特异性结合）较高，因此在进行DIP时，需设置严格的对照，并更谨慎地对结果进行验证。
4. DNA 6mA的测序鉴定
尽管6mA在哺乳动物基因组中的含量远低于5mC，近年来它仍然得到了越来越多的关注。DNA 6mA的测序主要依赖6mA抗体识别携带该修饰的DNA片段，该方法被证明具有较高的假阳性【23】。由于6mA是细菌中丰度最高的DNA修饰类型，因此哺乳动物中6mA的鉴定极易受细菌污染影响。虽然高精度无污染的质谱鉴定提示哺乳动物基因组DNA 6mA含量非常低，但是最近一项研究显示6mA富集在线粒体中并具有重要功能【24】。（近日，BioArt总结了哺乳动物6mA的研究历程和争议，详见：学术争鸣 | 从迷雾重重到柳暗花明？全面起底DNA 6mA修饰相关研究的争议）
RNA修饰的生物发生和鉴定
1. mRNA内部最丰富的修饰：m6A
m6A是真核生物mRNA内部丰度最高的修饰，主要由METTL3，METTL14和其他蛋白（包括WTAP, VIRMA, HAKAI, Zc3h13和RBM15/15B）组成的甲基转移酶复合体催化【25-29】。另一个m6A甲基转移酶是METTL16，催化MAT2A mRNA的m6A。m6A的去除由FTO和ALKBH5介导。因此m6A是一种可逆的RNA修饰。
尽管目前已有多种m6A的高通量鉴定技术，并广泛的应用到m6A研究中，我们仍然需要对特定的检测方法保持谨慎的态度。基于m6A-seq技术可能由于m6A抗体的非特异性结合造成假阳性。最近，有研究者开发了非抗体依赖的m6A检测方法，采用特性的核酸内切酶识别携带m6A的序列【30，31】，然而由于内切酶的活性限制，该方法仅能识别一部分m6A motif。而基于化学标记的m6A鉴定方法【32，33】则极大地受化学反应效率的影响。因此，新m6A鉴定方法的开发仍有重要意义。
越来越多的证据支持m6A在生命活动中的重要性，但同时引发了许多疑问。1）FTO的底物和功能。许多研究将FTO作为m6A去甲基化酶开展功能研究，然而实际上FTO被证明有多种催化底物（包括mRNA 的m6A和m6Am,tRNA的m1A和snRNAm6Am等）（NCB | 这一次，FTO是snRNA的m6Am去甲基化酶），目前还不清楚FTO如何选择和调控不同的底物并在细胞活动中发挥功能。2）m6A在可变剪接中的功能。虽然m6A甲基化酶，去甲基化酶和阅读蛋白都能影响可变剪接【34-36】，但有研究发现在mES中m6A对RNA剪接不是必需的【37】。因此，有关m6A如何直接或间接影响剪接事件，还需进一步研究。3）m6A在抗病毒反应中的功能。目前研究发现m6A可以修饰寨卡病毒（ZIKV）、丙型肝炎病毒（HCV）、A型流感病毒（IAV）和人免疫缺陷病毒（HIV）的RNA（新冠病毒RNA也存在丰富的修饰，详见此前报道：Cell | SARS-CoV-2转录组与RNA修饰图谱）。m6A可以抑制ZIKV病毒的感染【38】，但能促进IAV病毒的表达【39】。然而目前对m6A如何调控病毒RNA命运，以及为什么对不同病毒的作用不同，还不清楚。
2. m6Am修饰
当真核生物mRNA 5‘帽子后的第一个A携带2-O-甲基化（Am）时，可以被甲基化酶PCIF进一步催化为m6Am。然而目前m6Am的测序鉴定方法都基于使用m6A抗体（m6A抗体可识别m6A和m6Am），再辅以其他分析。因此，还需开发更特异的m6Am鉴定方法。另外，m6Am的功能还有较大争议。m6Am最开始被鉴定为与RNA稳定性相关【40】，而后的研究发现m6Am仅影响一小部分的mRNA的半衰期【41】，m6Am还可以影响mRNA的翻译效率【42】。因此，关于m6Am对mRNA命运决定还需进一步研究。
3. m1A修饰
m1A是m6A的异构体，甲基被连接到N1而不是N6位。m1A富集在tRNA，rRNA和mRNA上。甲基转移酶复合体TRMT6-TRMT61A介导mRNA上的m1A，而另一个复合体TRMT61B 和TRMT10C介导线粒体mRNA上的m1A。m1A的去甲基化由ALKBH1,ALKBH3和FTO负责。
最近，多个独立课题组开发了的高通量测序方法（包括m1A-ID-Seq【43】, m1A-Seq, m1A-MAP【44】和m1A-Seq-TGIRT【45】），然而这些方法在mRNA上仅鉴定到几十个到几百个m1A位点，而质谱显示m1A/A约为0.01~0.05%，这提示mRNA上的m1A位点应有上千个，也说明现有的m1A鉴定技术的灵敏度有限。
4. m5C，hm5C和ac4C修饰
tRNA, rRNA和mRNA均有m5C修饰，其中mRNA上的m5C由NSUN催化。借鉴DNA 5mC的鉴定方法，m5C也可采用改良的重亚硫酸盐测序法进行单碱基精度的鉴定【46,47】，但同样会面临RNA降解的问题。Aza-IP和miCLIP是无需重亚硫酸盐处理的m5C鉴定方法，但需要过表达甲基化酶，这可能导致假阳性以及不能真实反映真实条件下m5C的分布。目前hm5C和ac4C的鉴定都依赖于相应的抗体，无法达到单碱基精度。因此，我们期待未来能有准确性更高的m5C，hm5C和ac4C检测方法。
5. 假尿嘧啶Ψ修饰
假尿嘧啶Ψ被认为是RNA的第5个碱基，是RNA上最丰富的修饰类型，主要集中在tRNA，rRNA，snRNA和mRNA上。假尿嘧啶的生成依赖两类假尿苷合成酶（pseudouridine synthases，PUSs）：“stand-alone” PUSs不需要共因子（cofactor），而RNA依赖的PUSs需要H/ACA box snoRNA帮助识别靶RNA。由于假尿嘧啶与N-cyclohexyl-N’-β-(4-methylmorpholinium) CMC（ethylcarbodiimide）反应会生成CMC-Ψ，影响逆转录反应，研究者们根据这一特点开发了CeU-Seq【48】。目前已在mRNA上鉴定了约2000个假尿嘧啶位点，而根据质谱检测结果，mRNA上的假尿嘧啶修饰丰度应该和m6A相当【49】。
6. m7G修饰
m7G是tRNA和mRNA 5‘帽子的经典修饰，而最近的研究表明在mRNA内部也存在m7G修饰。METTL1-WDR4复合体是可将m7G加到tRNA和一部分mRNA内部。目前已有基于抗体和化学方法的m7G检测技术（m7G-MeRIP-Seq【50】和m7G miCLIPSeq【51】）。得益于这些技术，mRNA内部的m7G被认为与翻译相关。但是，考虑到m7G在tRNA上的富集，今后的研究还需更谨慎的区别m7G在不同RNA上的功能。
长读段测序在DNA/RNA修饰检测中的应用
上述提及的测序技术都被测序长度限制，而三代测序可以进行长片段的读取，并且具有直接获取DNA/RNA修饰（无需抗体或化学处理）的潜力，具有重要意义。修饰会改变核苷酸匹配的效率，SMRT测序通过检测不同荧光标记的dNTP/NTP结合目标核苷酸的时间差异来计算单核苷酸精度的修饰【52】。同时，修饰也会改变核苷酸的电信号，而Nanopore测序通过检测核苷酸通过纳米孔径的电信号来计算携带的修饰【53】。虽然这两种三代测序技术具有很好的应用前景，但目前的计算方法和技术还存在较高的假阳性，需要进一步改进和提升。
总结和展望
总的来说，DNA/RNA修饰的鉴定技术在不断更新，向我们展示了DNA/RNA修饰在生命活动中的重要功能。但未来仍需要准确度更高，更负担得起的检测方法对修饰位点进行单碱基精度的检测，以便我们解析这些修饰如何影响RNA命运并参与各种生理过程。
原文链接：https://link.springer.com/content/pdf/10.1007/s13238-020-00733-7.pdf
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