学术争鸣 | 从迷雾重重到柳暗花明？全面起底DNA 6mA修饰相关研究的争议
编者按：围绕DNA新修饰6mA的争议巨大，BioArt编辑部在广泛听取了十多位海内外专家的意见的基础上专门对整个研究历程以及争议进行了回顾和描述，本着对科学负责的态度，BioArt编辑部保持了最大的独立性完成此文，全文8000多字，历时一年左右完成。尽管争议还在继续，但是相信这篇文章对关心和希望了解6mA领域的读者有一定的帮助，至于是非曲直，留给读者去思考和判断。
DNA上的新修饰6mA。图片引自：https://phys.org/news/2015-05-dna-modification-inheritable.html。Credit: Lei Chen
撰文 | 小柚
责编丨丁广进
DNA甲基化是最早被发现，也是目前研究最深入的表观遗传调控机制之一。哺乳动物中最主要的DNA修饰是5mC（5-甲基胞嘧啶），占人类DNA中总胞嘧啶的3%~6%【1】。相反，5mC在原核生物中很少，而6mA（N6-甲基腺嘌呤，对应RNA上的修饰成为m6A，请读者注意区分）则是原核生物中最具代表性的DNA修饰，主要参与限制-修饰系统（restriction-modification），保护个体免受外来DNA的侵入。尽管哺乳动物中缺乏已知的限制-修饰系统，但近年来的研究在真核生物，甚至包括哺乳动物和植物基因组中鉴定到了6mA，并发现6mA在生长发育和疾病调控中具有重要作用。这些研究掀开了真核生物表观遗传修饰的新篇章。但同时，随着关注的增加，不同的声音也不断被发出，一场围绕真核生物中DNA 6mA修饰的相关争议早已拉开帷幕，而最为激烈的是关于哺乳动物基因组中是否存在6mA的争议。
一、 “繁花似锦”——真核生物中6mA的鉴定历程
2015年，Cell连发3篇研究（入选当期Cell杂志的封面论文），首次报道藻类【2】、果蝇【3】和线虫【4】的基因组中具有6mA修饰， 并配同期评论“An Adenine Code for DNA: A Second Life for N6-Methyladenine【5】”，认为真核生物中6mA的发现，将赋予6mA研究的第二次生命。
仅过去一年，2016年Nature发表研究报道6mA在小鼠胚胎干细胞中存在，并参与转座子活性的调控，同时鉴定了ALKBH1为6mA去甲基化酶【6】。
6mA在真核生物中的鉴定研究，不少论文登上Top期刊，足以说明6mA带来的惊喜和受到的巨大关注。
随后，越来越多的研究团队加入6mA研究。
2018年7月，Molecular Cell发表利用SMRT测序首次获得人类细胞的DNA 6mA修饰图谱的研究，证明6mA在人类基因组（包括线粒体基因组）中广泛存在，并且癌组织中6mA的丰度显著低于正常组织，同时鉴定了N6AMT1为6mA甲基化酶【7】。（详见BioArt报道：Mol Cell丨晏光荣肖传乐等合作解码人类基因组新型甲基化修饰）。4个月后，Cell发表6mA在神经胶质瘤中的研究，发现6mA在脑癌干细胞中的含量高于正常神经组织，并且靶向6mA去甲基化酶ALKBH1有望成为治疗该类癌症的新策略（详见BioArt报道：Cell丨谢琦博士等揭示DNA新修饰6mA在神经胶质瘤中的作用）【8】。
同时，植物6mA研究也在如火如荼的进行，势头不亚于6mA在人类中的研究。2017年，水稻和拟南芥基因组中6mA修饰图谱于2018年分别发表在Nature Plant【9】，Molecular Plant【10】和Development Cell【11】。
不仅科学研究者们看到了6mA的潜力，多家测序公司也嗅到商机，声称可开展6mA测序鉴定服务，绘制特定体系中的6mA图谱 。
参考RNA m6A被证明广泛存在于mRNA并参与多项生命活动进程后的火热程度，许多研究同行预见DNA 6mA可能将成为表观遗传领域的热门新领域！
二、“针锋相对”——6mA的鉴定争议
虽然6mA在高等真核生物中的研究看起来花团锦簇，但我们仍然难以绘制6mA分布图谱和了解它的生物学意义，这是因为不同研究中6mA的丰度，分布和功能在有巨大差异。在植物和真菌中，6mA主要富集在基因转录起始区，与转录激活有关，丰度在0.05%至2.8%【2，11】。在脊椎动物中，6mA主要富集在转座子区【6】、异染色质区【8】甚至基因编码区【7】；而6mA的丰度在不同哺乳动物和组织中竟相差10000倍（0.0001%~1%）【7, 8，12-14】！
这些差异，特别是6mA的丰度差异，是由于物种或组织特异性造成的？还是由于实验手段和方法的差异造成的？当6mA的丰度为0.0001%时，相当于每百万个腺嘌呤核苷酸（A）仅有10个携带6mA修饰，这样低的丰度，真的具有生物学功能吗？是否是检测时的污染？
关于真核生物是否真的具有6mA修饰，学界一直存有争议。
Schiffers S和Ratel D等分别在Angew Chem Int Ed Engl【9】和FEBS Lett【10】发表研究直言小鼠中不存在6mA修饰。但这两项研究并未引起太大关注。
2019年6月，波士顿儿童医院的Eric L. Greer 博士在BMC Genomics发表研究 “Sources of artifact in measurements of 6mA and 4mC abundance in eukaryotic genomic DNA”，该研究发现由于检测技术中存在污染，目前大部分研究都高估了真核生物中6mA和4mC的含量。质谱检测（UHPLC-MS/MS，ultra-high performance liquid chromatography tandem-mass spectrometry）是各类修饰鉴定的金标准。在DNA 6mA的质谱检测中，需要使用核酸酶和磷酸酶将待检测DNA消化成单个脱氧核苷酸分子，而目前使用最广泛的核酸酶和磷酸酶都来源于细菌。细菌中含有高丰度的6mA，这可能使这些酶携带6mA。确实，研究者检测了目前市面上3款常见的核酸酶和磷酸酶:Nuclease P1，Nuclease S1和DNA degradase plus，发现它们均含有6mA修饰的污染。当采用这些酶处理的水作为对照，并将其中6mA含量设置为背景值时，研究者发现包括线虫（这也提示研究人员，基于线虫体系围绕6mA开展的进一步深入研究所得出的结论【19】也需要重新审视），小鼠和人在内的多个物种，6mA含量非常低，甚至检测不到（< 0.00003% for 6 mA）。这说明6mA在某些哺乳动物中的高丰度，是由细菌污染造成的；当排除细菌污染后，6mA在哺乳动物中的含量非常非常低。（值得注意的是，该研究的通讯作者Eric L. Greer之前是施扬教授的博士后，也是2015年在Cell线虫中6mA鉴定研究的第一作者。虽然BMC Genomics杂志的影响因子不高，但该研究的作者中有施扬和何川两位领军人物的名字，足以说明他们对该研究提及的细菌污染问题的重视。）
此外，今年3月，来自瑞典林雪平大学的Colm E. Nestor教授在Science Advance发表研究“No evidence for DNA N6-methyladenine in mammals”，通过多种检测方法，严格的对照设置和分析，对6mA在基因组中的存在进行了全方位否定。基于6mA抗体的Dot blot和DIP-seq，质谱和基于测序方法的SMRTseq（根据甲基化修饰会影响DNA合成速度间接反应6mA的含量）是6mA检测的最常用方法。其中，Dot blot和DIP-seq的准确性主要依赖6mA抗体的特异性。研究者采用全基因组扩增DNA(whole genome amplification DNA,WGA DNA，经PCR产生，无6mA修饰)作为阴性对照，检测了多种组织和细胞系中6mA的含量。经检测，它们的6mA Dot blot强度与WGA DNA（阴性对照）相当，提示6mA的含量很低。
研究者进一步分析了已发表的6mA位点和丰度研究，发现即使是相同的组织或细胞，DIP-seq和SMRTseq检测到的6MA位点仅1~8%重合，质谱检测到的6mA含量更是相差10~1000倍，说明这些6mA的差异是课题组的不同造成的，而不是其本身的差异。总的来说，该研究认为迄今发表的研究无法支持哺乳动物基因组中存在6mA修饰或者有高丰度。
三、 “峰回路转”——6mA在哺乳动物基因组中存在，但却不是表观遗传标记(epigenetic mark)
6mA在人类基因组中的丰度差异，促使研究者们开发更精确，稳定和无污染的质谱方法鉴定6mA的含量。
今年3月，来自德国IMB的Christof Niehrs教授在Nature Chemical Biology【11】发表文章发现，哺乳动物基因组中的6mA含量很低（每百万个A中仅6~13个携带6mA修饰），并且这些6mA并不是由甲基化酶催化的，而是来自m6A RNA的甲基分解代谢和再利用，由DNA聚合酶将携带6mA的核苷酸整合到基因组中。
Nature Chemical Biology同期配了来自英国牛津大学的Paolo spingardi和skirmantas Kriaucionis对该研究的评论“How m6A sneaks into DNA”。他们指出，DNA修饰的低丰度，并不能成为我们质疑其生物学功能的论据，但是当某种修饰的含量非常稀有时（例如6mA在哺乳动物基因组中的含量），就可能使其在细胞中的功能受到挑战。并且，6mA通过核酸代谢回收途径被整合到基因组中，使得它难以成为一种表观遗传标记。对于在哺乳动物中具有重要功能的DNA 5mC修饰，细胞有一套机制严格地限制来自核酸分解代谢产生的5mC掺入基因组中，以确保其精确的定位。而6mA掺入基因组似乎没有被限制，这提示6mA本身的分布（在基因组上的精确定位），可能并不重要。
4月，中国科学院的汪海林教授（2015年与陈大华教授合作在Cell发表果蝇中DNA 6mA鉴定研究）在Cell Research也发文报道6mA通过DNA聚合酶X家族成员非模板依赖的Polyλ掺入基因组中【12】。在体外实验中，研究者将N6mdATP代替部分dATP与高保真DNA聚合酶Taq（模板依赖的聚合酶）共同孵育，发现6mA可被掺入PCR反应中；而当N6mdATP与dATP的比例降低至1：1000时，PCR产物中则检测不到6mA，这说明N6mdATP并不是一种友好的DNA合成底物，且高保真Taq酶更倾向于使用dATP而非N6mdATP。而在细胞周期的G1期，非模板依赖的Polyλ将6mA核苷掺入基因组；敲低Polyλ可显著降低G1期和sub G1期6mA的水平。同时，研究者利用CRISPR敲除潜在的6mA甲基转移酶METTL4和去甲基酶ALKBH1后（关于催化DNA 6mA的酶目前并没有定论，还处于争议之中），发现UPHLC-MS/MS分析方法并不支持它们是6mA相关催化酶，因为6mA的水平均未发生明显变化（详见BioArt报道：Cell Research | 汪海林团队发现哺乳动物存在DNA 6mA新来源）。值得注意的是，该研究未发现DNA 6mA可通过RNA m6A代谢掺入，与前述Nature Chemical Biology论文中的结论相左。因此，关于基因组中低丰度的6mA来源，还需进一步的研究。
四、柳暗花明？6mA作为表观遗传标记参与线粒体生命活动的调节
目前6mA的研究不仅仅是它本身的鉴定和功能研究，更涉及到了6mA甲基化酶和去甲基化酶的鉴定，并且敲低或过表达这两类酶，也成为研究6mA功能的重要手段。如果6mA在基因组中的含量很低，那么这些酶在细胞中的真实底物是什么呢？
事实上，关于6mA的甲基化酶和去甲基化酶，学界也颇多争议。
2016年，Andrew Z. Xiao教授在小鼠中鉴定ALKBH1为6mA去甲基化酶【6】。2018年，晏光荣和肖传乐教授则鉴定了N6AMT1作为人的6mA甲基化酶【7】。而谢琦教授等以神经胶质瘤为模型，发现N6AMT1并不具有6mA甲基化酶活性，而ALKBH1具有去甲基化酶活性（该研究为谢琦，Jeremy N. rich和Andrew Z. Xiao两方课题组合作完成）【8】。
2019年，南加州大学医学院的Douglas E. Feldman教授将METTL4和ALKBH4分别鉴定为6mA修饰的甲基化酶和去甲基化酶（但是并没有提及N6AMT1和ALKBH1）（详见BioArt报道：Mol Cell | 又见新的DNA 6mA催化酶！）。
今年2月，清华大学的李海涛教授和Andrew Z. Xiao教授，中国农业大学的陈忠周教授与中科院生物物理所闫小雪分别在Cell Research发表研究，解析了ALKBH1作为哺乳动物DNA 6mA去甲基化酶的自由态以及与DNA底物结合后的复合物结构及工作机制（详见BioArt报道：Cell Research背靠背 | 李海涛、陈忠周团队分别发文揭示哺乳动物中DNA 6mA去甲基化酶ALKBH1的工作机制）。
蛋白结构是功能的基础，结构解析往往为我们了解蛋白提供了“眼见为实”的证据。由此，虽然6mA甲基化酶尚存争议，但似乎ALKBH1是6mA去甲基化酶，至少在体外实验中证明ALKBH1是6mA去甲基化酶。而6mA在哺乳动物基因组中的含量非常稀少，ALKBH1作为去甲基化酶，能发挥多大的生物学功能呢？一时间，疑问更多了。
今年3月，芝加哥大学的何川教授在Molecular Cell发表的研究为6mA研究提供了新的方向【15】（详见BioArt报道：Mol Cell | 何川团队揭示哺乳动物线粒体DNA中6mA修饰的存在和功能）。该研究发现哺乳动物中的6mA修饰主要集中在线粒体DNA上（平均每个mtDNA分子有4个6mA），而核基因组DNA的6mA量极低。同时，研究者鉴定了主要定位在线粒体中的METTL4，是6mA的甲基转移酶（这与南加州大学医学院的Douglas E. Feldman教授的结论一致，但他们当时认为METTL4介导核基因组的6mA修饰，但是该结果与最近施扬教授团队发表在Cell Research上的结果相左，施扬团队证明METTL4催化的底物是RNA而不是DNA）。6mA阻碍线粒体转录因子结合mtDNA，从而减弱mtDNA的转录和拷贝数（mtDNA copy number）。在低氧情况下，6mA的水平上升，提示6mA与线粒体压力应答过程相关。
那么，ALKBH1是否定位在线粒体中并发挥mtDNA 6mA去甲基化酶的功能呢？已有研究表明ALKBH1可以定位在线粒体中，功能包括调控线粒体tRNAMet的2’-O-甲基化【15】，线粒体RNA granule的形成【16】和拷贝数【17】等。而关于ALKBH1是否调控mtDNA 6mA尚不清楚。
综上，关于N6AMT1和ALKBH4，ALKBH1的功能，它们真正的催化底物，都需要进一步研究。
五、雄关漫道真如铁，而今迈步从头越
从2015年首次在真核生物中被鉴定到如今5年多的时间里，6mA获得了广泛的关注，也引发了激烈的争议。我们对6mA的态度也从期待变成了审慎。6mA在哺乳动物中的低丰度，与其高度的动态性有关吗？由DNA聚合酶掺入的6mA是随机分布的吗？是否具有生物学功能？目前鉴定的m6A相关催化酶，是真实的吗？
目前的表观遗传研究为我们回答这些问题，提供了一些线索，当然也引发新的疑问。
1）6mA的高度动态性；
在果蝇胚胎中，6mA的丰度在胚胎发育的0.75h内达到顶峰（~0.07%，6mA/dA），而后迅速降低，4h后仅剩~0.001%【3】，另外两篇文章也提到了斑马鱼的猪的胚胎发育过程以及小鼠应对环境变化中DNA 6mA具有高度动态性【20，21】，由此可见，6mA的丰度呈高度动态性，对其鉴定也需要把握时机。而目前哺乳动物中6mA的鉴定多集中HeLa，HEK293T和mES等有限的细胞系中，这可能导致无法真实反应6mA在哺乳动物中的丰度。因此，为更准确的了解哺乳动物中6mA的含量，还需扩大检测范围（如检测各发育时期中6mA的丰度）。
2）单一位点的单个修饰也有大功能；
虽然有关6mA的丰度尚存争议，但是高精度质谱检测已提示6mA在哺乳动物中的含量非常有限，这也为6mA的生物学功能画了问号，丰度低就说明没有什么大功能吗啊？那么，表观遗传修饰的丰度和生物学功能间是怎样的关系呢？
今年5月，澳大利亚新南威尔士大学的Merlin Crossley 教授在Nature Communication发文“Methylation of a CGATA element inhibits binding and regulation by GATA-1”【18】，该研究发现c-kit基因座位的单个5mC甲基化位点就足以影响转录因子GATA-1对该基因座位的结合，并调控造血系统的正常发育。这从某种程度上说明低丰度的表观遗传修饰也可通过影响某一生物过程的关键基因而发挥巨大作用。因此，为探索6mA的生物学功能，开发可信赖的6mA分布位点检测方法是十分必要的。
六、关键论文作者的回应
6mA研究出现了很多的争议和讨论，Bioart联系上述研究中的多位相关人士了解他们对于该领域的看法，有永远不信的、有将信将疑的、有绝对相信的，当然还有一直观望看戏的。此外，BioArt特别邀请了两位直接参与实验的关键论文第一作者Tao P. Wu博士和Eric L. Greer博士，谈谈他们对6mA的鉴定和相关催化酶的看法。
Tao P. Wu博士（现在贝勒医学院人类与分子遗传系建立实验室）早前在耶鲁大学的Andrew Z. Xiao教授实验室做博后，是6mA在小鼠胚胎干细胞中的鉴定和发现ALKBH1是6mA去甲基化酶的研究的第一作者【6】，同时也是2018年Cell论文（6mA修饰与胶质瘤）的共同第一作者【8】。Tao P. Wu博士关于小鼠ESC中6mA含量低和受质谱中核酸酶的污染等问题做出了回应：
“虽然越来越多的证据显示m6dA是哺乳动物中一种功能性的DNA表观修饰，但是仍然有来自阴性结果的质疑，需要进一步探讨。在我们发表第一篇Nature文章之后，德国的Thomas Carell研究小组发文声称在wild-type mouse ES cell 中检测不到m6dA (with UPLC-MS/MS)。读者如果熟悉干细胞研究相关背景的话，应该很清楚小鼠干细胞的培养有多种条件与方法，其中尤其以培养基对细胞状态的影响最大。Andrew Z. Xiao实验室正在撰文，描述它们对DNA修饰的影响。最近，Eric Greer小组（postdoc in Yang Shi Lab before）又发表结果，声称DNA digestion enzyme含有来自细菌DNA 的污染。这在我们和其他几个实验室做UPLC-MS/MS检测的时候，都没有发现类似的结果；相关的对照实验结果我们也会放在未来的文章当中。对于SMRT Sequencing, Shijia Zhu & Gang Fang在Genome Research文章中已经进行过讨论（Nat Rev Genet发表房刚组细菌表观组综述论文），在m6dA丰度极低的情况下，SMRT 会产生假阳性结果。这也正是为什么，该领域亟需新的方法和研究模型。最近，肖传乐 & Kai Wang发表文章，尝试了利用机器学习算法分析Nanopore sequencing数据来读取DNA修饰信息。Tao P. Wu实验室也在开发新的方法，拓展新的研究模型。”
Eric L. Greer博士早前是施扬教授的博士后，鉴定了线虫中的6mA【4】，并发现哺乳动物的6mA可能来源于核酸酶的污染。Eric L. Greer博士目前在哈佛医学院独立开展研究工作，就目前鉴定的6mA相关催化酶的看法如下：（原文附在译文之后）
“就哺乳动物6mA催化蛋白的酶活性而言，这些蛋白都是我们之前在线虫中鉴定的6mA相关催化酶的同源蛋白。我们在体外条件下得到的酶活性不能真实反应生理条件下该酶的催化活性，但是实验间的平行性差（当我们有关线虫中6mA及相关催化蛋白的文章出来时，我们已鉴定了哺乳动物中6mA催化酶，只是这些结果太初步了）。这可能是由于我们未得到最佳的酶反应条件，也可能这些酶有其他的更主要的作用底物，而当过表达它们到过高的浓度时，它们也可以完成N6位的甲基化和去甲基化过程。如果这些酶最主要的底物是其他物质（比如RNA或者其他DNA修饰），当在某一体系中过表达超高浓度的你感兴趣的蛋白，来迫使它们发挥功能时，你可能被结果所欺骗，认为找到了正确的底物。这就是为什么进行酶活性动力学实验非常重要，这有利于确认它们在生理条件下的活力。”
（以下为邮件原文：In terms of the enzymatic activity of the mammalian proteins these have all been identified as homologues of proteins that we identified in C. elegans. We have found that we get spurious activity of these proteins in vitro but it is not consistent from experiment to experiment (we had actually identified the mammalian proteins at the same time when our C. elegans story came out but thought they were too preliminary). This could reflect that the enzymatic conditions are not optimal or that these enzymes have another primary substrate and when forced in excessive concentrations to methylate or demethylate N6 on adenosine they will. If the primary target of the enzyme is something else (say RNA or another DNA modification) you can still force activity by overloading the system with really high concentrations of your enzyme of interest and trick yourself into thinking that it is the right target. That is why it is important for showing methylases and demethylases to perform kinetic experiments to determine whether the enzymatic activity would be physiologically relevant.）
实际上，不仅是6mA相关催化酶，包括目前最受关注的RNA m6A修饰，其去甲基化酶FTO的身份也经历了多次质疑和反转（详见BioArt报道：不能把“功劳”都算到m6A头上，FTO不仅仅是m6A去甲基化酶；NCB | 这一次，FTO是snRNA的m6Am去甲基化酶 ）。由此可以看出，甲基化酶和去甲基化酶可能同时存在多种催化底物，比如FTO可同时介导m6A和m6Am去甲基化，解析其生理条件下最主要的催化底物才是关键。
此外，BioArt编辑部也注意到在国家自然科学基金中，有235万元的项目涉及6mA，包括6mA在植物和动物中的多项研究。鉴于6mA的争议和其在线粒体稳态维持的功能，今后的研究需秉持更加严谨和科学的态度，为我们揭开高等生物中6mA的全貌。
编后记：对于争议领域来说，正常的学术讨论是非常有必要的，讲究“有一份证据说一分话”，最好做到不打棍子，不扣帽子。新兴领域出现争议是再所难免的，面临争议就需要更多的研究同行携手探求科学的本质，努力就本领域的问题达成共识，良性的学术讨论环境才能促进领域扎实的向前发展。
BioArt特别提醒有兴趣研究DNA 6mA生物学功能的实验室，从事DNA 6mA有较高的门槛，目前除了高灵敏度的质谱技术（排除了可能污染）以外，基于抗体、三代测序的技术都存在很大的不确定性，再者围绕6mA修饰的相关酶类也存在极大的争议，因此，围绕6mA开展生物学功能研究的时候都需要采取审慎的态度，切勿盲目跟风下结论。
围绕6mA修饰的讨论还会持续下去，就这个话题BioArt也非常欢迎相关专家来稿发表不同的观点和意见。上述文章也并未对每一篇相关文章都进行了展开，限于学识和水平，文中错误疏漏之处在所难免，还请读者包容！
编者特别感谢一年多来，何川（芝加哥大学）、施扬（哈佛医学院）、陈大华（中科院动物所）、李海涛（清华大学）、伊成器（北京大学）、杨运桂（中科院基因组所）、汪海林（中科院生态环境研究中心）、房刚（美国西奈山医学院）、蓝斐（复旦大学）、吴涛（贝勒医学院）、谢琦（西湖大学）、刘颖（北京大学）、骆观正（中山大学）、陆发隆（中科院遗传发育所）、沈立（浙江大学）、Eric L. Greer（哈佛医学院）等多位专家就DNA 6mA修饰相关研究坦诚地提供相关信息和个人观点，部分专家审阅全文并提出了宝贵意见。
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