专家点评Nat Methods | 新一代乙酰胆碱探针实现体内乙酰胆碱信号的精确解析
点评 | 许晓鸿（中科院神经科学研究所）、Marina Picciotto （美国医学科学院院士）
责编 | 兮
神经系统实现复杂行为背后，不同神经元之间如何进行有效的信息传递和整合，以及信息传递的异常是否导致特定疾病的发生，均是神经生物学领域的关键问题。乙酰胆碱作为经典的神经递质，是神经元之间信息沟通的关键媒介分子，其参与了生长发育、感知及运动、心血管功能、高级认知如学习记忆等诸多重要生理功能的调控【1-3】。由于神经系统的复杂性和乙酰胆碱的功能多样性，精确解析乙酰胆碱信号的动态变化，如特定神经元是否在行为的某个阶段释放或接收乙酰胆碱信号，可以帮助我们深入了解乙酰胆碱的生理学意义。同时，探究乙酰胆碱信号在阿兹海默症、心血管疾病、肿瘤等疾病中的变化，也有助于探究和解析疾病的发病机理或临床症状的成因。
2020年9月28日，北京大学李毓龙实验室和北京脑科学与类脑研究中心井淼实验室合作在Nature Methods杂志以Article形式在线发表了题为“An optimized acetylcholine sensor for monitoring in vivo cholinergic activity”的研究论文，报道了新一代高灵敏乙酰胆碱荧光探针的开发及其在多种模式生物中的成功应用。
应用光学成像的方法检测乙酰胆碱等神经递质在近年来取得了巨大的突破，这主要得利于新型荧光探针的开发及其广泛应用。自2018年起，北京大学李毓龙等课题组首次应用G蛋白偶联受体（GPCR）作为蛋白骨架，构建了一系列可以精确检测神经递质动态变化的荧光探针，即GPCR-Activation Based (GRAB)探针【4-7】（详见BioArt报道：NBT | 北大李毓龙组开发新型乙酰胆碱荧光探针——专家点评；Cell丨李毓龙组开发新型多巴胺荧光探针——仇子龙点评）。该方法将结合特定神经递质（如乙酰胆碱）的GPCR与循环重排的荧光蛋白（cpGFP）相连接，使得受体结合神经递质后的空间构象变化转变为荧光信号的变化，从而实现报告神经递质的浓度变化。结合光学成像手段，GRAB探针系列目前已在多项工作中成功实现了神经递质信号及其功能在活体动物中的解析【8-10】。
在本工作中，为了进一步提高乙酰胆碱探针的表现，研究者基于已发表的第一代GRAB乙酰胆碱探针进行了突变筛选和理性设计，成功获得了对乙酰胆碱具有约300%荧光信号响应的新版本探针（ACh3.0），其在信号幅度上相比第一代探针有3倍以上的提升，且仍保持着对乙酰胆碱的分子特异性和亚秒级的动力学特性。更重要的是，通过对探针进行设计和优化，ACh3.0探针在结合乙酰胆碱后不会激活内源的信号通路，这使得探针可以安全的作为“检测器”表达于细胞上，而不会对细胞本身的生理功能带来影响。综合而言，新版本的探针在检测乙酰胆碱方面兼具了细胞特异性表达、高灵敏性、高亲和力、快速反应速率以及高选择性，这为其在活体内精确解析乙酰胆碱的动态变化奠定了基础。
图一：新一代乙酰胆碱探针的开发及其刻画。
a: 针对乙酰胆碱探针的关键位置进行突变筛选成功获得新一代探针ACh3.0，其在信号幅度和基础亮度上都显著优于已发表的ACh2.0探针。同时，针对受体结合乙酰胆碱位点的突变获得对照探针ACh3.0-mut，可在活体应用中作为阴性对照证明乙酰胆碱信号的特异性。
b: 不同版本乙酰胆碱探针在培养的HEK293T细胞中的表达情况及其对乙酰胆碱的荧光响应。
在对乙酰胆碱探针进行优化和一系列刻画后，随后研究团队在多种模式生物中应用了探针，并成功地检测了内源的乙酰胆碱在不同脑区的释放及其调控。如在转基因果蝇中，研究团队揭示了活体果蝇在接受不同生理刺激时，嗅觉中枢蘑菇体存在区域特异性的乙酰胆碱释放，提示不同区域的乙酰胆碱信号可能具有截然不同的生理功能编码。在活体小鼠中，结合新一代乙酰胆碱探针和光纤记录或微型化双光子显微镜成像【11】，研究者成功记录到了乙酰胆碱信号在包括杏仁核、海马、皮层等不同脑区相关的多种行为，如惩罚性电击刺激、睡眠觉醒的不同时相、以及感觉刺激和运动状态变化等过程中，如何动态变化及其在细胞尺度上的精细时空分布，这种快速灵敏的变化是采用传统方法无法检测的。新一代乙酰胆碱探针不仅可灵敏地追踪短暂电击刺激导致的快速乙酰胆碱升高，也可稳定地报告跨越数小时范围的不同睡眠觉醒状态下的脑内乙酰胆碱水平变化，这将对更深入地研究乙酰胆碱的生理和病理功能提供重要工具。
图二：新一代乙酰胆碱探针在果蝇及小鼠中的成功应用。
a: 应用新一代乙酰胆碱探针ACh3.0观测到活体果蝇嗅觉中枢中，特定生理刺激引发的区域特异性乙酰胆碱信号变化。其中，ACh3.0相比于ACh2.0具有明显提高的活体检测灵敏度。
b: 新一代乙酰胆碱探针ACh3.0记录到小鼠基底外侧杏仁核（BLA）处在小鼠受到电击刺激时的乙酰胆碱释放。研究者应用对照探针ACh3.0-mut或特异性敲除乙酰胆碱囊泡转运体VAChT的小鼠作为对照，证明检测到的荧光信号为乙酰胆碱浓度变化导致。
北京脑科学与类脑研究中心的井淼博士为本文章的第一作者，井淼博士与北京大学李毓龙博士为文章的共同通讯作者。北京大学已毕业本科生李玥璇及CLS项目博士生曾健智、钱统瑞、潘孙磊等对文章做出了重要贡献。国内外合作团队在该工作中起到不可或缺的作用，包括中科院神经科学研究所徐敏实验室、华中科技大学李浩洪实验室、北京大学分子医学研究所陈良怡实验室和程和平实验室、加拿大西安大略大学Marco Prado, Lisa Saksida, Vania Prado和Tim Bussey实验室，以及美国南加州大学Andrew Hires实验室。
俗话说，“眼见为实”。对于细胞水平生物学现象的研究很多时候依赖于新技术的开发，使得这些现象可以被可视化从而量化研究。这一点在高度复杂的神经系统中尤为凸显。在过去几年中，北京大学李毓龙实验室开发了多种神经递质分子探针，分别针对乙酰胆碱 (ACh)【4】、多巴胺 (DA)【5】、去甲肾上腺素 (NE)【7】和腺苷(Ade)【9】等。结合这些分子探针与活体成像技术， 研究人员可以在清醒活动动物的神经系统中，原位、高敏感度、长时间和细胞特异地检测到各种神经递质的实时释放，大大推动了脑科学中前沿问题的研究。
在这篇新发表在Nature Method的文章中，李毓龙实验室对于2018年初次报道的乙酰胆碱分子探针进行了近一步的优化。新版本的ACh3.0里，作者通过突变循环重排绿色荧光蛋白和连接区域的关键位点，在维持原有探针敏感度的同时，极大增加了乙酰胆碱结合后的探针荧光的亮度值，同时还清除了与下游信号通路的偶联，进一步提高了分子探针的信噪比。相关的，作者还构建了一个不结合乙酰胆碱的对照分子探针作为阴性对照, 并在乙酰胆转运体敲除动物中，严格证明分子探针所检测信号来源于突触释放的乙酰胆碱。通过在果蝇蘑菇体KC细胞中表达ACh3.0，作者们在体证明ACh3.0的性能大大优于之前的版本, 甚至可以监测到单个pulse的光遗传学激活所诱发的乙酰胆碱释放。并且ACh3.0与小鼠实验中的光纤记录和双光成像高度兼容。例如通过光纤记录，作者们发现小鼠海马中的乙酰胆碱水平在睡眠的不同阶段动态变化。
任何技术的开发和革新都不是一蹴而就的。较之最初的“设计灵感”，更重要的也许是持之以恒的迭代更新。对应着每一代的“更强更好”的分子探针，都会有更多的之前所不能被探索的科学领地和问题向研究者们“开放”。乙酰胆碱作为一种重要的神经递质，调节诸如睡眠、注意力和决策以及感觉信息处理等重要行为，而乙酰胆碱能神经元的功能异常也与阿尔茨海默病和精神分裂症有关。豪无疑问的，通过分子探针将乙酰胆碱释放可视化，将大大加快我们对于这一递质在脑中作用机理以及参与行为调节的具体机制的理解。事实上，自2018年首次报道以来，乙酰胆碱分子探针的论文在短短两年内已经被引用上百次。而这次看似“渐进”的分子探针性能优化，我相信很有可能会带来突破性的进展。
Yulong Li and his colleagues are changing the neuroscience field can do with the tools they have developed for measuring neurotransmitter levels in vitro and in vivo. In their latest work, published in Nature Methods, they validate an optimized acetylcholine (ACh) sensor, called GRABACh, that has the sensitivity and kinetics to provide real time information on ACh release in behaving animals.
While in vivo neurochemistry has been used to measure neurotransmitter dynamics via microdialysis, voltammetry or amperometry for many decades, these methods have serious limitations related to time resolution, level of detection and specificity that have limited the ability to evaluate neurotransmitter release accurately. This has been especially difficult for ACh, which has been technically challenging to measure. The need for an in vivo ACh sensor has been a significant gap in the field that has limited conclusions that can be drawn about what events lead to ACh release, how long ACh transients persist in vivo and how those transients contribute to behavior. The development of GRABACh and its careful and rigorous characterization is an enormous step forward for research on the function of ACh specifically, and for the neuroscience field more broadly.
李毓龙等研究团队正在通过发展新型技术来革新神经生物学领域对于体内和体外神经递质的检测方法。在最新发表于Nature Methods的工作中，他们开发并刻画了新一代的乙酰胆碱探针，GRABACh3.0, 证明其具有在自由运动的小鼠中实时检测乙酰胆碱释放的高灵敏性及快速动力学。
几十年来，经典的检测活体生物体内神经递质动态变化的方法，如微透析检测、电化学检测等，均在时间分辨率、检测灵敏度或特异性等方面具有较大的局限性。这使得科学家难以精确地解析神经递质，尤其是乙酰胆碱在体内的释放过程。长久以来领域内一直亟需一种可用于活体的乙酰胆碱检测方法，从而让科学家可以回答一些重要问题，如乙酰胆碱究竟在什么事件中释放，每次释放持续多久，以及释放如何导致行为的改变。本工作中对于GRABACh乙酰胆碱的开发以及详尽的性质刻画，将是未来神经科学家探索乙酰胆碱的重要里程碑。
原文链接：
https://doi.org/10.1038/s41592-020-0953-2
参考文献