Sci Immuno丨张志斌团队揭示肿瘤逃逸细胞焦亡的新机制

细胞焦亡 (Pyroptosis) 是由膜穿孔蛋白gasdermin (GSDM) 介导的程序性细胞坏死【1】。人类GSDM家族包括六个成员，其中GSDM A/B/C/D/E的N端片段 (N-terminal fragment, NT) 具有膜穿孔活性。GSDMD介导的细胞焦亡在拮抗病原感染的先天免疫反应中起重要作用，而其它一些GSDM (包括GSDMB和GSDME) 介导的细胞焦亡则在抗肿瘤免疫中扮演着重要角色【2】。张博士的早期工作表明杀伤性淋巴细胞 (主要包括自然杀伤（NK）细胞以及CD8杀伤T细胞) 可以通过Granzyme B (GzmB) 激活癌细胞中的GSDME，从而诱发细胞焦亡，而这一焦亡能够进一步激发抗肿瘤免疫反应，抑制肿瘤生长【3】（Bioart: Nature背靠背 |  张志斌/刘志博/邵峰等揭示细胞焦亡在肿瘤免疫方面的全新功能）。与之相应的是，GSMDE的表达在多种癌细胞中由于启动子甲基化而受到抑制。北生所邵峰院士团队亦鉴定了GzmA-GSDMB通路并报道了类似结果【4】(Bioart: 更新认识丨邵峰组Science报道细胞毒性淋巴细胞诱导细胞焦亡的机制)。然而让人惊讶的是GSDMB在多种癌细胞中过表达，且其高表达水平与癌症病人不良预后成正相关【1】。最近的一些研究更对GSDMB在细胞中的膜穿孔活性提出了质疑【5, 6】。因而GSDMB在肿瘤免疫中的功能有待进一步的研究。

2023年4月28日，德州大学MD Anderson癌症中心张志斌课题组在Science Immunology上发表文章，题为：Alternative splicing of GSDMB modulates killer lymphocyte–triggered pyroptosis。研究报道了不同GSDMB可变剪接异构体 (splicing isoform) 在杀伤性淋巴细胞介导的细胞焦亡及抗肿瘤免疫中的不同功能，并揭示肿瘤细胞可通过操控GSDMB可变剪接从而逃避细胞焦亡的全新机制。

文章作者首先注意到GSDMB至少有五种可变剪接异构体GSDMB1-5,而之前的研究使用了不同的异构体。作者在HEK293T以及细菌中表达了5个GSDMB-NT，发现只有包含完整6号外显子的GSDMB3 NT和GSDMB4 NT能够导致细胞或细菌的死亡。这些数据解释了文献中关于GSDMB NT 膜穿孔活性看似相互冲突的结果。最近发表的三篇文章也得出了类似的结论【7-9】（ Nature背靠背 | 丁璟珒/邵峰团队合作揭示GSDMB膜打孔介导细胞焦亡的结构基础和调控机制；Nature背靠背 | 阮建彬课题组揭示GSDMB 成孔机制及病原体逃逸天然免疫的分子机制）。通过对多种癌细胞的分析，作者发现GSDMB1/2/3在细胞中丰度较高，而GSDMB4/5表达极少。通过NK细胞NK92 MI与HeLa癌细胞（过表达单个GSDMB异构体）共孵育的杀伤实验，作者发现全长的GSDMB3，而非 GSDMB1 与GSDMB2，能够介导细胞焦亡。有意思的是，全长的GSDMB4能够部分抵御GzmA的切割，因而表达GSDMB4的细胞部分发生了焦亡，部分死于凋亡。这些结果表明GSDMB3是介导细胞焦亡的主力。

为了进一步研究为什么不同GSDMB剪接异构体具有不同的膜穿孔活性，作者使用AlphaFold预测了不同GSDMB NT的结构，并与已发表的GSDMA3 以及GSDMD 的晶体及冷冻电镜结构进行了对比。GSDMB剪接异构体在一小段区域内表现出序列差异，而 GSDMA3 和GSDMD中的这一区域形成了一个保守的带状结构。结构预测显示毒性（cytotoxic）GSDMB3和GSDMB4 NT能都形成保守的带状结构，而无毒性（noncytotoxic）NT则不具备类似结构，表明这一保守的带状结构是GSDM成孔所必须的。流行观点认为GSDM NT的成孔需经历三个步骤：1）结合细胞膜脂质，2）多聚化， 3）细胞膜插入。作者的分析显示所有的GSDMB异构体 NT都能够结合脂质并多聚化。但对于膜插入，现阶段并没有实验手段能够直接验证。由于无毒性GSDMB NT能够正常的结合膜脂质并多聚化，如果其不能插入细胞膜，可以想见，当其与毒性NT形成异源多聚体时，这些异源多聚体会表现出减弱的膜穿孔活性。作者进一步验证了这一假设，其结果表明无毒性GSDMB1/2异构体能够抑制毒性GSDMB3诱导的细胞焦亡，是GSDMB细胞焦亡的负调控因子。

进一步的生物信息学分析表明，相对于相邻的正常组织，癌症病人样品中无毒性GSDMB1/2的表达在多个癌症中被上调，而毒性GSDMB3/4则倾向于在癌症中被抑制。另外， GSDMB rs11078928次要等位基因（minor allele）的纯合子会导致6号外显子跳跃（exon skipping），因而该纯合子只表达不含6号外显子的无毒性GSDMB1/2剪接异构体【10】。全基因组的关联分析表明，GSDMB rs11078928次要等位基因的纯合子与东亚人宫颈癌风险增加有关。这些结果表明癌细胞可能通过上调GSDMB细胞焦亡的负调控因子，即无毒性GSDMB剪接异构体，或者抑制毒性GSDMB剪接异构体，从而达到逃避细胞焦亡，促进肿瘤发生的目的。这也解释了早期研究中的观察：GSDMB（实为无毒性GSDMB剪接异构体）在多种癌细胞中过表达，且其高表达水平与癌症病人不良预后成正相关。综上所述，这一研究的结果表明GSDMB的可变剪接是一个可能的新药物靶点，操控肿瘤细胞中GSDMB的可变剪接从而上调毒性GSDMB异构体表达可能会提高抗肿瘤免疫反应。

德州大学MD Anderson癌症中心的孔青博士与加州理工大学的夏时雨博士为本文的共同第一作者。孔青博士与张志斌博士为本文的共同通讯作者。德州大学奥斯汀分校的潘兴鑫博士和伊松教授, 乔治亚大学的叶凯雄教授，MD Anderson的研究生李舟祎晗，李浩妍博士，唐晓强博士，Nidhi Sahni教授，中科院巴斯德所的刘星教授，加州理工/HHMI的Michael B. Elowitz 教授，哈佛医学院的吴皓教授和Judy Lieberman教授亦对本研究做出了重要贡献。

原文链接：

http://doi.org/10.1126/sciimmunol.adg3196

制版人：十一

参考文献

1. X. Liu, S. Xia, Z. Zhang, H. Wu, J. Lieberman, Channelling inflammation: gasdermins in physiology and disease. Nat Rev Drug Discov 20, 384-405 (2021).

2. Q. Kong, Z. Zhang, Cancer-associated pyroptosis: A new license to kill tumor. Frontiers in immunology 14, 1082165 (2023).

3. Z. Zhang et al., Gasdermin E suppresses tumour growth by activating anti-tumour immunity. Nature 579, 415-420 (2020).

4. Z. Zhou et al., Granzyme A from cytotoxic lymphocytes cleaves GSDMB to trigger pyroptosis in target cells. Science,  (2020).

5. N. Rana et al., GSDMB is increased in IBD and regulates epithelial restitution/repair independent of pyroptosis. Cell 185, 283-298 e217 (2022).

6. J. M. Hansen et al., Pathogenic ubiquitination of GSDMB inhibits NK cell bactericidal functions. Cell 184, 3178-3191 e3118 (2021).

7. S. S. Oltra et al., Distinct GSDMB protein isoforms and protease cleavage processes differentially control pyroptotic cell death and mitochondrial damage in cancer cells. Cell Death Differ,  (2023).

8. C. Wang et al., Structural basis for GSDMB pore formation and its targeting by IpaH7.8. Nature 616, 590-597 (2023).

9. X. Zhong et al., Structural mechanisms for regulation of GSDMB pore-forming activity. Nature 616, 598-605 (2023).

10. F. S. Morrison et al., The splice site variant rs11078928 may be associated with a genotype-dependent alteration in expression of GSDMB transcripts. BMC genomics 14, 627 (2013).

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