癌症免疫疗法：基于RNA的免疫调控基因电路
基于RNA的免疫调控基因电路
一千个读者就有一千个哈姆雷特，同样的一千个科研工作者就有一千个合成生物学。一些科研工作者试图重走生命进化之路，他们先是合成原核生物支原体，接着合成真核生物酵母，雄心勃勃的他们现在更是想合成更加复杂的人类细胞；另一些科研工作者试图给生命体注入新的人造碱基、人造氨基酸、人造能量系统等；还有一些人试图通过改造现存生命来解决人类所面临的环境、能源、材料、健康等方面的问题，本文介绍的就是这个方向下合成生物学用于癌症治疗的一个研究。
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作者：罗训训
编辑：邓婷月 孟凡康 张益豪
肿瘤是由于基因组和表观基因组变化而导致的一种疾病，属于多基因疾病，遗传、环境、DNA随机复制错误是导致肿瘤发生的三个因素。根据Cristian Tomasetti的研究结果，癌症发病因素5%来自于遗传因素，28.9%来自于环境因素，66.1%来源于DNA的随机突变[1]！虽然人类为了战胜癌症付出了巨大的努力，包括手术、放疗、细胞生长信号通路抑制剂、PD-1等免疫检查点抑制剂、细胞疗法等都极大的提升了肿瘤患者的生存率，但是癌症仍然是人类的第二大杀手，中国的癌症情况则更加不乐观[2]，如表一所示。
表1：全球各区域世界人口标准发病率、死亡率和死亡发病比
2017年是CAR-T疗法元年，FDA前后批准了诺华公司的Kymriah和凯特公司(被吉德利公司收购了)的Yescarts两款CAR-T上市，免疫疗法在血液瘤中取得了极大的成功。但是CAR-T疗法也存在诸多问题，包括细胞因子风暴引起的不良反应、实体瘤效果不好与个体化方案治疗昂贵的三个主要问题，其次寻找肿瘤表面特异的抗原靶标也有一定困难。而下文介绍的Timothy K Lu团队设计的免疫基因调控电路在一定程度上可以规避上述CAR-T疗法带来的问题。
他们设计的基因电路通过识别细胞内的转录因子而定位肿瘤，通过释放免疫刺激物来激活免疫系统杀死肿瘤细胞(图1)。我认为多信号输入提高肿瘤靶向精确性、多信号输出提高肿瘤杀伤效果是本文的特色，其中提高肿瘤细胞识别的精确度是重中之重。
图1：在癌细胞中选择性激活的免疫合成基因电路 1.免疫基因电路通过以RNA为基础的与门将两个肿瘤特异性合成启动子(P1和P2)整合起来，只有当两个输入启动子具有活性的时候才会产生组合免疫调节剂输出，与门表达一个合成的转录因子(GAD：由GAL4 DNA结合结构域与VP16 转录激活结构域融合而成的蛋白)，它能启动组合免疫调节剂的共表达，这些免疫调节剂包括表面T细胞衔接器(STE是展示在细胞表面的抗CD3的分子)、分泌的CCL21、IL12 和anti-PD1抗体 2.这个基因电路中免疫调节剂的只在癌细胞(红色)而不在正常细胞(蓝色)中表达。黑线基因电路表示电路处于活性状态而灰线基因电路表示电路处于非活化状态 3.癌细胞特异性表达的组合免疫调节剂引起T细胞有效的杀死癌细胞
肿瘤细胞中特异性表达的启动子是精确识别肿瘤的第一个关键，肿瘤细胞中虽然有特异性表达的启动子，例如SSX1P和H2A1P，其启动子中含有很多转录因子结合位点(图2)，这些转录因子并不都是肿瘤特异性表达的，当启动子中只含肿瘤细胞中特异性表达的转录因子时，例如S(E2F)P、S(cMYC)P(图3)，启动子的特异性将进一步增强(图4)，SSX1P、H2A1P、S(E2F)P、S(cMYC)P的转录因子结合位点信息如表2所示。
图2：SSX1p,H2A1P启动子结构示意图
图3：S(cMYC)P,S(E2F1)P结构示意图
图4：控制mKate2 表达的合成肿瘤特异性启动子展示出更好的肿瘤特异性。SSX1P和H2A1P是对照，括号表示构建合成启动子所使用的转录因子结合位点。ɑHDF和HOV是正常的原代细胞，OV8是人卵巢癌细胞系
表2：天然与合成启动子比较
RNA层次的与门是精确识别肿瘤细胞的第二个关键，启动子1转录生成的RNA经过剪接后形成成熟的mRNA和siRNA，siRNA抑制mRNA的翻译，只有当启动子2产生的海绵RNA竞争走启动子1产生mRNA上的siRNA后，启动子1产生的mRNA才能翻译成蛋白质(图 5)，定义与门的效率=[1,1]/[1,0]。为了提高与门的效率，研究团队对siRNA的结构、海绵mRNA2的单体和高级结构进行了优化，最终使与门的效率达到了7左右。
图5： 四种可能的双信号输入与对应的单信号输出的状态 输入状态用方括号中数字表示，前面一个数字代表输入1的状态，后面一个数字代表输入2的状态，1代表活性状态，0代表非活性状态。在[1,0]状态，启动子1处于活性状表达mKate2的转录本(mk-Ex1和mk-Ex2分别表示mKate2 的外显子1和外显子2)，同时这个转录本中miR1通过靶向3’UTR来抑制mKate2的翻译，因此mKate2的水平很低。在[0,1]状态，启动子1处于非活性状态，因此输出蛋白mKate2不表达。在[0,0]状态，启动子1与启动子2均处于非活化状态，输出蛋白mKate2不表达。在[1,1]状态，启动子2转录结合miR1的海绵RNA ，这能隔离启动子1产生的miR1，从而mKate2能够翻译出来
多信号输出能协同杀伤肿瘤，研究团队选择趋化因子CCL21、细胞表面抗原STE、细胞因子IL 12和免疫检查点抑制剂抗体anti-PD-1 四个免疫调节剂作为杀伤肿瘤的输出信号，只有肿瘤细胞中才会有信号输出(图6)，趋化因子招募T细胞到肿瘤细胞旁，细胞表面抗原介导T细胞识别肿瘤细胞，细胞因子加强T细胞的杀伤活性，抗体anti-PD-1可解除肿瘤细胞对T细胞的抑制，小鼠实验表明利用T细胞和此基因电路可在体内杀伤肿瘤细胞(图7)[3]。
图6：合成基因电路引起人卵巢癌肿瘤特异性表达免疫调节剂。(*p < 0.05; **p < 0.005)
图7：小鼠从13天到39天的生物发光图
基因疗法在克服了上世纪90年代基因载体安全性问题之后再一次热了起来，并在治疗血友病、莱伯氏先天性黒蒙症等单基因疾病中取得了巨大进展，但是在肿瘤等多基因疾病的应用研究还比较少，本文也可以看成多基因疾病的基因治疗一个例子。Timothy K Lu团队在提高肿瘤识别精确度的启动子层次上已经做得相当好了，例如S(E2F)P在卵巢癌细胞中的表达量是正常卵巢细胞中的570倍，而且这种启动子的构建策略具有很好的扩展性;我认为在RNA层次上的与门还有提升的空间，首先基于RNA干扰的与门的效率在优化后仅在7左右，其次RNA干扰潜在的脱靶效应也有待进一步的验证，与RNA干扰通过降解RNA来控制翻译不同，生物体也可以通过抑制翻译起始来控制翻译，原核中Toehold switch的诱导倍数可高达600(图8)[4]，并且在多信号(大于2个信号)整合上极具优势(图9)[5],在真核细胞中通过翻译起始来控制翻译强度或许也能取得很好的效果，例如通过控制病毒的IRES(图10)的结构来控制翻译[6]；在输出信号的选择上，除了本文中的免疫调节物外，我要特别强调其他两个输出信号，第一个是溶瘤病毒的复制裂解能力[7]，它不仅可以自内而外的杀死肿瘤细胞，而且可以通过复制来维持基因治疗的疗效，甚至可以通过溶瘤病毒来选择靶向的组织细胞，第二个是前药转化酶，它本身不可以杀死肿瘤，只有在吃了前药后才能起作用，因而更加安全可控[8]。
图8：Toehold switch通过起始密码子(AUG)前后碱基配对来抑制翻译，而核糖体结合位点(RBS)和起始密码子则处于非配对状态。RNA-RNA的相互作用是通过叫做Toehold结构域的线性-线性相互作用来完成的，Toehold结构域a与trigger RNA上的a*结构域互补。结构域a和b分别有12和18个核苷酸
图9：通过2个输入RNA相互结合形成完整的trigger RNA实现与门
图10： dicistrovirus IGR IRES的二级结构，此IRES能直接与人类的核糖体结合并起始翻译的开始
在合成生物学的应用研究领域中，不仅需要对底盘生物的分子机制了然于心，还需要对应用领域的知识有个清晰的认识(例如我缺乏评价其小鼠实验结果应用前景的知识，这在应用领域是致命的)，最后希望合成生物学家能打通基础研究到应用研究的通道，让科技更好地造福人类。
[1] Cristian Tomasetti, Lu Li, Bert Vogelstein.Stem cell divisions,somatic mutations, cancer etiology, and cancer prevention,Science 24 Mar 2017, Vol. 355, pp. 1330-1334
[2] 段纪俊, 严亚琼, 杨念念,等. 中国恶性肿瘤发病与死亡的国际比较分析[J]. 中国医学前沿杂志:电子版, 2016, 8(7):17-23.
[3] Nissim L, Wu M R, Pery E, et al. Synthetic RNA-Based Immunomodulatory Gene Circuits for Cancer Immunotherapy.[J]. Cell, 2017.
[4] Green A A, Silver P A, Collins J J, et al. Toehold Switches: De-Novo-Designed Regulators of Gene Expression[J]. Cell, 2014, 159(4):925-39.
[5] Green A A, Kim J, Ma D, et al. Complex cellular logic computation using ribocomputing devices.[J]. Nature, 2017, 548(7665):117.
[6] Kerr C H, Jan E. Commandeering the ribosome: lessons learned from Dicistroviruses about translation[J]. Journal of Virology, 2016, 90(12):5538.
[7] Bischoff J R, Kirn D H, Williams A, et al. An Adenovirus Mutant That Replicates Selectively in p53- Deficient Human Tumor Cells[J]. Science, 1996, 274(5286):373-6.
[8] Mircetic J, Dietrich A, Paszkowskirogacz M, et al. Development of a genetic sensor that eliminates p53 deficient cells[J]. Nature Communications, 2017, 8(1).