使用TFF进行蛋白质选择性纯化 - 利用蛋白质复合物，实现基于粒径的分离
来自美国俄亥俄州立大学的研究人员在2021年第618期的《Journal of Membrane Science》杂志上发表了题为“Selective protein purification via tangential flow filtration – Exploiting protein-protein complexes to enable size-based separations”的文章。文中，研究人员指出，切向流过滤(TFF)是一种基于粒径的分离方法，通常用于缓冲液置换、浓缩、病原体去除以及粗提纯。在此研究中，其使用TFF选择性纯化复合形式的蛋白质。通过利用抗HSA多克隆免疫球蛋白G (IgG)作为目的蛋白结合分子(TPBM)，这一工艺被证明可以从人工合成的血红蛋白(Hb)和HSA的混合物以及血浆中回收人血清白蛋白(HSA)的复合物形式。此外，利用Hb作为TPBM，可从人Cohn组分IV中回收复合形式的结合珠蛋白（Hp）。Hb-Hp再以5 M尿素部分解离，获得Hp。在初步概念验证实验中，获得TP-TPBM的纯度为>95%，但回收率较低，不过研究人员同时建立的一个用于描述TFF纯化过程的简单数学模型表明，串联使用相同MWCO的TFF过滤器可在不损失纯度的情况下提高产品回收率。总结来看，研究提出了一种使用TFF和简单的数学模型来描述和预测TFF系统性能的蛋白质选择性纯化的新方法。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
简介
蛋白质纯化是市面上大多数生物药生产的基础。纯化的蛋白质产品可用于医疗保健的各个方面，如治疗药物、诊断试剂或科研。治疗性蛋白可用于补充或恢复生物功能(如血浆成分)或作为靶向治疗(如单克隆抗体)。诊断蛋白主要包括抗体检测系统和其它用于检测疾病标记物或生物功能障碍的生物分析方法。最后，由于需要科研来验证蛋白质的使用，研究性蛋白质涵盖了所有的应用领域。此外，除了生物药市场外，最近蛋白质作为生物催化剂的工业应用进一步增加了对蛋白质的需求。因此，鉴于对蛋白质的高需求，这些年来已经开发了许多蛋白质纯化方法。不过，尽管这些新方法降低了蛋白质的总成本，其生产成本的很大一部分仍然来自蛋白质纯化工艺。
大多数大规模的蛋白质纯化工艺依赖于多个层析步骤来达到所需的蛋白质纯度。这些层析步骤必须分别针对特定的目的蛋白进行优化。此外，传统的柱层析技术通常与高成本和低体积通量相关。因此，许多研究致力于开发非层析的纯化方法，如蛋白质沉淀或液-液分离。有趣的是，基于膜的体积排阻分离方法还没有被广泛用于选择性蛋白质纯化。目前，膜过滤应用主要包括溶液澄清(微滤)、去除病毒和细菌、蛋白浓缩以及缓冲液置换。
在本研究中，利用由目的蛋白（TP）和TP结合分子(TPBM)组成的蛋白质-蛋白质复合物所产生的分子大小变化，使用切向流过滤（TFF）从蛋白质混合物中纯化TP。此前的研究使用了类似的方法，被称为“亲和过滤”。然而，大多数研究使用吸附TP的固体基质或含有对TP有特异性并共价附着在基质上的配基。后来有研究采用结合至配基的水溶性聚合物作为TPBM。然而，在所有这些体系中，都需要一种不溶性亲和基质或偶联至配基的高分子量聚合物，以促进TP的选择性结合。我们的目标是证明可以使用的TPBM的选择范围更广，并且可以由能够选择性地与TP结合的简单蛋白组成。与聚合物TPBM相比，蛋白质是可行的替代品，因为聚合物可能吸附在过滤膜上，从而增加膜污染，且聚合物溶液往往具有高粘度，会降低过膜通量。更重要的是，基于蛋白质的TPBM可以被设计成具有所需的分子量且与TP有结合亲和性，以获得最佳性能。
类似的方法已被用于从外消旋蛋白溶液中分离对映异构体，但这种做法尚未被用于复杂混合物。此外，胶束增强超滤和螯合剂可用于低分子量有机或无机物的结合，但这种方法缺乏特异性，尚未应用于更大的蛋白质物质。最值得注意的是，静电蛋白质-蛋白质相互作用已被用于人工二元蛋白质混合物，以控制蛋白质截留(通过吸引性相互作用)和传输(通过Donnan效应)。虽然这一概念对于理解基于膜的蛋白质分离至关重要，但在从复杂的蛋白质混合物中分离特定蛋白质时缺乏选择性，因为杂质可能与TP具有相似的电荷。此外，即使是带有相似电荷的蛋白质也会有吸引性静电相互作用，产生的复合物可能会迅速沉淀，使得在针对复杂混合物使用此方法时的分析和执行复杂化。因此，我们使用特定的蛋白结合相互作用来产生所需的可溶性TP复合物，通过改变TP分子量的概念，从复杂混合物中高选择性地将TP分离出来。
简单来说，该方法使用具有明确MWCO膜的TFF，首先滤出低于膜MWCO的TP和其它蛋白质杂质(即滤液)。然后将TPBM加入到滤液中，与蛋白质混合物中的TP选择性地形成蛋白质-蛋白质复合物。当蛋白质混合物中只有高于原膜MWCO的TP-TPBM复合物时，其可从滤液中其它低分子量的蛋白质成分中被选择性的分离出来，即后者透过原MWCO TFF膜。然后，TFF可用于在解离条件下进行复合蛋白质的缓冲液置换，并利用MWCO在TP和TPBM分子量之间的膜将TP从TPBM中分离出来。整个工艺如下图所示。
基于蛋白质-蛋白质相互作用的亲和超滤示意图。从蛋白质/颗粒物的混合物开始(1)(例如：细胞裂解物、人血浆等)，混合物使用有合适MWCO的膜进行过滤，TP及低分子量杂质进入滤液（2）。对TP有特异性的TPBM(即抗体或等效物等)加入滤液。形成TP-TPBM蛋白质复合物，其大于原膜的MWCO(3)。含有新形成的TP-TPBM蛋白质复合物的溶液使用相同MWCO的膜再次过滤，目的TP-TPBM蛋白质复合物被截留，低分子量杂质被去除(4)。分离的TP-TPBM蛋白质复合物通过可促进其解离的缓冲液置换步骤解离，产生游离的TP和TPBM(5)。各个物质(TP和TPBM)在溶液中解离后，使用MWCO在TP和TPBM分子量之间的膜，从TPBM分离TP(6)。注意：回流液中的TPBM和滤液中的TP可通过TFF置换至合适的缓冲液，以去除解离试剂，并对分离的TP和TPBM进行浓缩。
在本研究中，研究人员介绍了两个使用上图所示方法的实验案例。此外，研究建立了一个数学模型，用于描述和预测产品的回收率和纯度，并对TP/TPBM配对和亲和性进行优化。研究进一步证明，该模型预测，顺序分阶段的方法可用于提高蛋白质-蛋白质复合物的回收率，而不损失产物纯度。
材料和方法
实验中的所有切向流过滤操作使用KrosFlo® KR2i 切向流过滤（TFF）系统及中空纤维过滤器组件进行。
实验过程概括如下：人血红蛋白（Hb）纯化（参考方法：使用切向流过滤法纯化血红蛋白）；人血清白蛋白（HSA）- IgG复合物形成；从人工形成的Hb和HSA混合物中纯化HAS-IgG：使用70 kD 中空纤维HF过滤器（mPES，20cm2，C02-E070-05-N）进行恒体积洗滤，截留HAS-IgG复合物（以PBS缓冲液洗滤13 DV）。
从人血浆中纯化HSA-IgG：人血浆使用70 kD HF过滤器以PBS洗滤15 DV过滤。70 kD HF过滤器的滤液使用50 kD HF（PS，20cm2，S02-E050-05-N）过滤器浓缩。然后加入IgG，形成HAS-IgG复合物。混合液重新用70 kD HF过滤器过滤，以分离HAS-IgG复合物（以PBS洗滤15 DV）。
从Cohn组分IV中纯化结合珠蛋白-Hb复合物：基于最近开发的以TFF纯化人结合珠蛋白（Hp）的工艺（参考方法：结合珠蛋白的分级切向流过滤，获得>95%纯度），使用蛋白质复合物纯化方法，从其废液中回收Hb-Hp蛋白质复合物。简单来说，人组分IV重悬并离心，以去除不溶性颗粒（大部分为脂蛋白）。上清液使用0.2 μm HF过滤器浓缩。回流液放置36 h，使低密度颗粒絮凝，而回流液于4℃保存，以待进一步处理。回流液絮凝后，分离溶液中的低密度颗粒。更高密度的组分使用PBS洗滤10 DV。0.2 μm过滤获得的滤液以一系列的HF 过滤器（750、500和100 kD）进行过滤。然后将Hb连续加入100 kD HF过滤获得的滤液，形成Hb-Hp蛋白质复合物，维持溶液中有过量的Hb，以结合滤液中所有的Hp。滤液/Hb混合物然后使用100 kD HF过滤器，以新鲜PBS洗滤，以去除过量的Hb和低分子量蛋白质。获得的Hb-Hp离心去除工艺中可能形成的不溶性颗粒。纯化工艺示意图下图所示。
通过TFF，从Cohn组分IV中纯化Hb-Hp蛋白质复合物的生产流程示意图。
从Hb-Hp复合物分离Hp：为促进Hb从纯化的Hb-Hp复合物上解离，使用70 kD HF过滤器，通过7 DV洗滤，将缓冲液置换为尿素溶液。获得的未折叠蛋白质混合物用尿素溶液进行10个洗滤循环，中间静置12小时，总共进行30个洗滤循环。然后溶液使用30 kD HF过滤器（mPES，20 cm2，C02-E030-05-N），以去离子水洗滤10个循环，再以PBS洗滤7个循环。该过程示意图如下图所示。
从Hb-Hp复合物中解离Hb、以分离Hp的示意图。括号中的数字表示过滤体积的数量。
详细的实验操作、分析方法、TFF建模以及结果和讨论，请查考原文。
单个阶段TFF系统示意图，用于TFF工艺建模(A)。30、70和100 kDa mPES HF过滤器规格，每种HF过滤器的拟合截留曲线基于希尔方程(B)。
本研究进行的建模研究的结果。（A）估计的截留曲线和研究中使用的物质的预期截留。可部分解释实验中因膜MWCO选择、目的产物实际分子量等原因而导致的产物损失。（B）使用70 kD HF过滤器，从高分子量杂质中分离HSA和低分子量物质。（C）使用70 kD HF过滤器，从低分子量物质中分离HSA-IgG复合物。（D）使用100kD HF过滤器从高分子量物质中分离Hp（四聚体和更高级别的Hp物质，以及虚线所示三聚体）以及低分子量物质。（E）使用100 kD HF过滤器从低分子量物质中分离Hp-Hb复合物（四聚体和更高级别的Hp物质，以及虚线所示三聚体）。阴影表示包括滤液(P)和回流液(R)的曲线范围。（A）-（E）解释了不同分离目的时，选择不同洗滤体积的原因。
总结：
本研究证实了通过蛋白质-蛋白质复合物（TP-TPBM）的使用，以TFF纯化目的蛋白(TP)的方法。初步实验显示，该分离策略可用于处理复杂混合物，获得>95%的产物(TP-TPBM)纯度。但在初步概念研究中，蛋白质回收率较低，幸运的是，研究证明了一个简单的数学模型可以用来指导这种纯化策略的应用和优化，即使在TP-TPBM复合物与复合物中单个蛋白(TP和TPBM)之间存在解离和结合反应的情况下。
原文：I.S.Pires, A.F.Palmer, Selective protein purification via tangential flow filtration – Exploiting protein-protein complexes to enable size-based separations. Journal of Membrane Science, 2021, 618: 118712.
KrosFlo® KR2i TFF 系统简介
Spectrum® 中空纤维过滤器工作原理
Repligen Corporation
41 Seyon Street, Building 1, Suite 100, Waltham, MA, 02453, USA
phone: 781. 250. 0111
Fax: 781. 250. 0115
Web: www.repligen.com
瑞普利金（上海）生物科技有限公司
中国（上海）自由贸易试验区张江路1238弄恒越国际大厦1号2层G座
电话：021 - 6881 0228
网站：cn.repligen.com
The trademarks mentioned herein are the property of Repligen Corporation and/or itsaffiliate(s) or their respective owners.