结合珠蛋白的分级切向流过滤，获得>95%纯度
来自美国俄亥俄州立大学的研究人员在2020年4月的《Biotechnology Progress》杂志发表了题为“Tangential Flow Filtration of Haptoglobin”的文章。文中，研究人员以人 Fraction IV（FIV）作为起始物料，使用切向流过滤（TFF），从血浆蛋白质中分离聚合性结合珠蛋白（Hp）。从FIV浆料悬液中去除不溶性物质后，以0.2μm中空纤维（HF）TFF过滤器对蛋白质混合液进行澄清。澄清的蛋白质溶液使用750、500和100kD HF过滤器，基于蛋白质分子量（MW），进行分馏。使用未处理的FIV时，主馏分中Hp纯度为~75%，即从500g FIV浆料开始，可获得总Hb结合载量（HbBC）产量1.2g。但如使用气相二氧化硅对FIV进行预处理，以去除脂蛋白后，Hp纯度可提高到>95%，每500g FIV的HbBC产量为1.7g。总结来说，研究为从血浆蛋白中纯化Hp，提供了一种新的、可放大的方法。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
简介
结合珠蛋白是一种α-2糖蛋白，主要负责清除无细胞血红蛋白（Hb）。尽管存在于哺乳动物的大多数体液中，但其在血浆中的浓度通常为0.5 – 3 mg/mL。结合至血浆中的无细胞血红蛋白后，Hb-Hp蛋白质复合物被CD163+巨噬细胞和单核细胞清除，以去除有毒性的无细胞Hb。无细胞Hb毒性源于多方面的因素，包括Hb外逸进入组织空间，引发氧化组织损伤，一氧化氮（NO）清除以及游离血红素的释放。这些因素会导致急性和慢性血管疾病、炎症、血栓形成和肾损伤。结合至Hp后，Hb-Hp复合物较大的尺寸可防止Hb外逸进入组织空间，从降低NO清除以及血管收缩。此外，Hp结合至Hb，可防止血红素从Hb释放，并降低Hb诱导的氧化损伤和炎症。出于这些原因，Hp在日本被用作治疗药物，并被研究用于治疗各种溶血性疾病。然而，此类治疗方案的临床转化依赖于从人血浆大规模纯化Hp方法的建立。因此，将这种蛋白质有效地开发用于溶血性疾病的治疗，新的Hp纯化策略必不可少。
Hp是由αβ二聚体组成的多态蛋白，其中β多肽链由同一基因编码，而α链由Hp1或Hp2共显性等位基因编码。这些基因导致在人体中存在三种主要的Hp表型：Hp1-1、Hp2-1以及Hp2-2。α和β链通过二硫键结合，β、α-1和α-2的分子量分别约为36、9和18kD。α链结构的差异导致了四聚体Hp1-1物质的形成（两个二硫键结合的αβ异二聚体二硫键结合通过α-1链），其中Hp1同型结合体分子量约为89kD，以及异型结合体（Hp2-1）或Hp2同型结合体（Hp2-2）形式的更高阶的Hp聚合物，异型结合体产生Hp2-1，一种平均MW约为200kD的线性Hp聚合物，高可达约500kD。最后，Hp2同型结合体产生Hp2-2，其是Hp的一种环状聚合物，平均MW约为400kD，范围为200-900kD。所有类型的Hp可通过一种几乎不可逆的反应，结合Hb，Kd范围为10-12 – 10-15M。此外，之前的研究显示，在Hb清除方面，Hp表型间无显著的差别。非共价连接主要发生在Hp的β链和Hb的β珠蛋白之间，每种αβ二聚体的理论摩尔化学计量为1:1。由于不同表型间Hp的MW不同，质量化学计量不一致，Hp1-1：Hb约为1.3:1质量结合比，Hp2-2：Hb约为1.6:1质量结合比。
另一种Hb结合物质是结合珠蛋白相关蛋白质（Hpr）。Hpr由比Hp1-1小的α和β链组成，主要为单αβ二聚体，但是可形成聚合物。Hpr与Hp1基因有>90%的序列一致性，可高亲和性地结合至Hb。但与Hp不同的是，Hpr中的α链不会通过二硫键共价结合至其它α链而形成αβ聚合物，所以一般认为Hpr聚合物通过非共价反应连接。Hpr的生理作用与正常Hp不同，因为Hpr不结合至CD163受体，且在溶血状态时，不会增加表达。相反，Hpr会与高密度脂蛋白形成复合物，在人体中形成针对锥虫病的免疫力。
鉴于Hp清除Hb的功能，其可在以溶血状态为特征的疾病（如溶血性贫血、大量输血等）中作为治疗药物。在此类状态中，红细胞（RBC）破裂，释放无细胞Hb，其可清除NO，导致血管收缩以及自由基和活性氧的形成，后者可导致周围组织氧化损伤。在日本，Hp的临床应用在针对烧伤的治疗中已经显示出了积极的结果，且可在外科手术中作为预防性措施，如体外循环心脏搭桥。除了常见的溶血性疾病外，Hp的其它应用包括治疗脓毒性休克、用作抗炎药以及用于储存RBC的脱毒。此外，Hp还可以与RBC或基于Hb的氧载体（HBOC）一同使用，以预防和治疗无细胞Hb相关的副作用。总体来说，Hp可用于体循环中、在不同条件下存在、添加或诱导的无细胞Hb的脱毒。
由此可见，Hp在生物医学领域具有广阔的应用前景。但是，Hp的广泛使用需要可放大且高效的生产方法，以提供治疗所需的较大剂量。目前的Hp生产方法包括使用Hb-亲和层析、疏水作用层析、阴离子交换层析或重组Hp表达。层析通常收率降低，且受限于层析柱的蛋白质结合载量。此外，亲和层析可能需要使用严苛的解离条件，以从层析基质释放Hp。最后，重组Hp需要蛋白水解酶的共表达，相比血浆来源的Hp，其可能具有不同的糖基化模式，且不容易规模放大。
本文介绍一种基于切向流过滤（TFF）的Hp生产方法，其可为从血浆馏分生产Hp提供一种简单、可放大且经济高效的方法。本研究使用的血浆馏分由通过Kistler和Nitschmann的改良Cohn工艺获得的Cohn Fraction IV组成。已知该馏分含有来自血浆的高MW Hp（Hp2-2和Hp2-1）。低 MW Hp（较小的Hp2-1聚合物和Hp1-1）主要存在于Cohn Fraction V中。所以，Cohn Fraction IV中较宽的Hp聚合物MW分布有利于从其它血清蛋白（基本低于100kD）中，对Hp进行基于粒径的分离。
在本研究中，开发了两种用于分离Hp的方法。第一种不使用可结合至脂蛋白的气相二氧化硅（FS），而第二种方法使用FS，以去除脂蛋白，促进TFF分离。本文主要关注使用FS的Hp纯化工艺，因其可获得更高纯度的Hp产物。
材料和方法
实验中，切向流过滤使用Repligen的KrosFlo Research 2i TFF系统（KR2i）及中空纤维（HF）过滤器组件。
使用TFF，结合气相二氧化硅，进行Hp纯化。使用Kistler和Nitschmann改良的Cohn工艺获得的500 g人Fraction IV（FIV）浆料悬浮于5 L PBS中，在搅拌机中均质。获得的混合液于4℃搅拌过夜。~5L溶液以3700 g离心45 min，去除不溶性脂质。将气相二氧化硅（FS）以20 mg/mL的浓度加入样品，4 ℃搅拌过夜。溶液离心去除二氧化硅团聚体。二氧化硅颗粒再以PBS漂洗两次，以提高蛋白质回收率。FS上清溶液使用0.2 μm HF 过滤器浓缩至800 mL，并洗滤15体积，泵流速设置为900 mL/min。0.2 μm滤液使用750 kD HF 过滤器浓缩至150 mL，再洗滤100体积。泵流速750 mL/min。滤液再使用500 kD HF 过滤器，以PBS溶液洗滤40体积，泵流速750 mL/min。最后，500 kD滤液使用100 kD过滤器，以PBS溶液洗滤100体积，泵流速750 mL/min。下图所示为纯化工艺和整体时间线的示意图。~150 mL的750 – 500 kD（高分子量，HMW）和500 – 100 kD（低分子量，LMW）溶液分别使用100 kD HF过滤器浓缩至~5 - 10 mL的HMW和~40 mL的LMW馏分（浓缩泵速设置为33 mL/min）。样品使用0.2 μm针头式过滤器除菌过滤，并于-80℃储存。每次过滤后，HF过滤器使用0.1 M 氢氧化钠和25% （v/v）乙醇溶液充分清洗。过滤器以0.1 M NaOH储存，使用前用去离子水润洗。
实验中用于纯化Hp的HF 过滤器的详细规格。
使用TFF进行Hp纯化的流程图和时间线。
产物质量分析操作，请参考原文。
结果
使用TFF生产Hp
方法中描述的Hp的TFF生产程序包括5个不同的阶段，每个阶段可分离不同MW的蛋白质馏分。这5个阶段为蛋白质被0.2 μm TFF过滤器截留（阶段0，0.2 μm回流液）、0.2 μm和750 kD TFF过滤器之间的馏分（阶段1，0.2 μm - 750 kD）、750 kD和500 kD TFF过滤器之间的馏分（阶段2，750 – 500 kD）、500 kD和100 kD TFF过滤器之间的馏分（阶段3，500 - 100 kD），以及最后，100 kD TFF过滤器的滤液（阶段4，<100 kD）。
从表中结果可见，FIV不是主要由可溶性蛋白质组成。以FIV浆料的~100 mg/mL悬液作为起始物料，溶液仅含~24 mg/mL的可溶性总蛋白。所以，仅约25%的FIV质量由可溶性蛋白质组成。一些不溶性物质在离心步骤中被去除，即约有150 - 200 g不溶性物质被去除。
考虑到大部分血清蛋白的MW小于100 kD，所以悬液中的大部分蛋白质可滤过100 kD过滤器，导致在阶段4，有65%的可溶性蛋白质损失。但是，由于Hp具有较宽的MW范围，且FIV含有大部分聚合性Hp，阶段3截留了FIV中较高的HbBC馏分，而总蛋白截留较低，说明在此>100 kD MW馏分中，Hp以高纯度存在（即每毫克总蛋白中的HbBC最高）。在阶段2，具有相似的HbBC和总蛋白比例，但纯化的量较小（~4 mL，浓度50 mg/mL），大部分产物在阶段3被截留（~35 mL，浓度100 mg/mL）。阶段2较低的总蛋白截留说明主要的Hp聚合物可滤过500 kD过滤器。然而，500 kD过滤器上的截留，阶段2由高MW（HMW）Hp聚合物组成，而阶段3由低MW（LMW）Hp组成。不同MW的Hp聚合物可便于评估Hp聚合物尺寸对在不同疾病状态中的治疗指数的影响。此外，根据MW范围，阶段2和3中的Hp聚合物主要由Hp2-2和Hp2-1的混合物组成，因为FIV中存在的所有Hp1-1都太小了（主要存在于Cohn Fraciton V中），不能在阶段3中被截留。
有意思的是，阶段0具有与阶段3相似的Hp组成，但是阶段0含有不容易通过离心去除的不溶性悬浮物质。所以在本研究中，阶段0不被认为是主要的Hp产物。此外，实验可见，通过0.2μm和750kDHF 过滤器，可对蛋白质进行高效的过滤，因为在阶段0或阶段1中，几乎没有蛋白质被截留。不过在不使用FS时，情况并非如此。此外，TFF前使用FS，在工艺中的所有阶段，可使滤液流速提高至少一倍。这样做时，尽管需要在工艺前进行更多的离心，但相比不使用FS的工艺，FS可极大地降低整体工艺时间。最后，FS处理不仅可优化工艺，两个主要的Hp产物（阶段2和阶段3）也得到了显著的提升。相比不使用FS处理的样品，阶段2和阶段3均显示出了单位总蛋白中更高的HbBC含量。
不过，对于Hp纯化，不仅大部分蛋白质滤过100 kD 过滤器，但也有近50%的起始HbBC滤过100 kD过滤器，说明这些Hp物质由<100 kD的小Hp聚合物组成。所以，降低阶段3进行的洗滤次数或使用更小MWCO的过滤器可提高此类物质的截留，但可能会降低产物纯度。
从HPLC结果可确认FIV悬液主要由<100 kD的蛋白质组成（~9.2 min洗脱时间）。此外，可观察到LMW物质滤过阶段2（750 - 500 kD）和3（500 - 100 kD），大部分存在于100 kD滤液当中。而且，750 - 500和500 - 100 kD馏分显示几乎相同的峰。更为重要的是，相比不使用FS的产物，阶段2和3具有降低的非-Hb-结合蛋白的左尾端。根据峰洗脱时间，阶段2和3中的蛋白质产物的平均MW分别为520±30 kD和390±20 kD。所以，尽管FS预处理去除了较大的~7.5 min洗脱物质，大MW蛋白质通过TFF过滤器的通量提高了，相比不使用FS的产物，每个阶段截留的平均蛋白质粒径更大。蛋白质通过TFF过滤器渗透的增加也体现在在阶段0中，即没有~9.2 min的峰，说明了这些~100 kD物质的高通过。
从SDS-PAGE明显可见，阶段2和3主要由Hp组成。在标准蛋白质上样凝胶上可见，基于密度测定的阶段3的纯度为>95%。纯度水平与之前日本报道的商品化聚合性Hp产物相似或更高。MS分析也显示阶段2和3主要由Hp组成。此外，可确定一致的低水平杂质。有意思的是，在阶段2和3的SDS-PAGE中仅观察到了低强度的α-1 Hpr条带，说明Hpr的MS离子强度可能由于Hpr和Hp1-1较高（>90%）的序列一致性而被错误分配。为更好地鉴定并评估蛋白质纯度，对轻度过载的SDS-PAGE凝胶进行了密度分析。
从纯度评估结果可见，HMW馏分由>80%纯Hp组成，LMW馏分由>90%纯Hp组成。因此，与每mg总蛋白中更高的HbBC一致，证实了FS的使用可极大地提高两种主要Hp产品的纯度。然而，SDS-PAGE上用于检测蛋白的染色在高蛋白浓度浓度条件下，没有随浓度的增加而线性增加。因此，由于SDS-PAGE检测这些杂质需要轻微过载，Hp的纯度可能高于表3所示的值。此外，通过与密度分析的小偏差，证实该方法可获得一致的产物组成。
从FIV浆料悬浮在PBS中到储存纯化的Hp样品，整个Hp纯化过程耗时7天。这包括三天的离心和四天的TFF处理。使用本研究中的设置，不需要连续监测系统，因为工艺可达到一个稳定的状态，其中，一个过滤器的滤液进入下游过滤器的样品容器。这减少了操作人员监控工艺所需的总时间。此外，为了降低与缓冲液使用相关的成本和所需的总过滤时间，未来的研究将专注于优化每个阶段的洗滤次数，以在维持产品纯度的同时，最大限度地提高产品回收率。通过使用更大的TFF过滤器（即更大的膜表面积）处理相同量的FIV，工艺时间也可以很容易地缩短。这可缩短整个工艺时间，但也将增加该工艺的投入成本。
根据本研究中描述的实验室规模工艺，生产Hp的物料成本主要包括FIV浆料和工艺所需的缓冲液。每批500g的FIV浆料大约需要$250。此外，该工艺使用了~100 L缓冲液，用于洗滤步骤和HF过滤器的清洗。如果缓冲液的成本为$3/L，则缓冲液的总使用成本为~$300.65，因此生产Hp的成本为$150/g Hp（$300/IU Hp）。每克Hp的成本可以通过增加TFF系统的起始蛋白质负载来降低。例如，在处理前将1 kg的FIV溶解至5 L的PBS中，与500 g批次相比，Hp的产率大约可提高两倍，而纯度没有明显差异。此外，除产生主要产品Hp外，该纯化工艺还可从阶段4产生蛋白混合物，其可作为常规层析纯化的起始物料，以生产其它低MW Hp。
尽管FIV的起始物料是混合的人血浆，可能有与感染性物质相关的安全风险，但Cohn酸-乙醇分馏和TFF处理的结合内在地降低了这些风险。TFF澄清使用0.2 μm和750 kD HF过滤器，去除大部分致病菌。对于病毒来说，Cohn酸-乙醇分馏工艺可使各种病毒降低约4log10（LRV）。此外，使用TFF进行纳滤，可再降低5（LRV）。最后，如有需要，Hp样品可以进行最后的除病毒步骤，如溶剂/去污剂步骤，以达到所需的病原体降低水平。
目前工艺可放大性的一个缺点是需要使用离心机来去除未溶解的脂质和/或FS。深度过滤可能可替代用于去除未悬浮脂质的离心步骤。
总结
以500 g Cohn Fraction IV浆料作为起始物料，可获得1.7g HbBC，纯度>95%，即溶液中总蛋白浓度为~100 mg/mL，HbBC为~52 mg/mL。进一步的研究将关注于优化洗滤体积，以降低工艺时间和缓冲液用量。总结来说，本研究介绍了一种用于生产大量高纯度的高MW Hp（Hp2-2和Hp2-1的混合液）的新型优化方法。
本文部分内容翻译自原文，内容有删减，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。
原文：I.S.Pires, A.F.Palmer, Tangential Flow Filtration of Haptoglobin, Biotechnology Progress, 2020, doi: 10.1002/btpr.0000.
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