质粒DNA小规模GMP生产：简化的完全可抛弃型生产方法
来自荷兰肿瘤研究所以及AmBTU等的研究人员在2019年的《Journal of Biotechnology》杂志上发表了题为“Small-scale GMP production of plasmid DNA using a simplified and fully disposable production method”的文章。文中，作者介绍了一种用于生产小批次（1-4mg）质粒的“规模缩小”GMP生产方法。本文为原文内容简介，详细内容，请参考原文。
简介
过去几年来，基因和细胞治疗已经成为各种疾病极具吸引力的治疗选择。除了常用的病毒载体外，使用质粒DNA的非病毒基因递送方法也非常引人关注，因为其通常更加便宜，也更易生产。对于临床应用，需要GMP级质粒DNA，此外，研究人员已报导了用于DNA免疫的大规模（100mg）批次质粒DNA的生产方法，但近来，对用于I/II期试验的小量质粒DNA的需求在增加。除了临床I/II期研究外，小量的质粒也可用于动物实验和对量要求较小的中试研究。为此，课题组开发了一种小规模生产工艺，生产方法是GMP生产工艺的规模缩小版本，其可用于提供小量（1-4mg）的质粒DNA。相比之前的大规模方法，该生产方法有两个主要的特点：1）不需要任何专门的生产设备，如生物反应器或层析系统；2）所有材料均为可抛弃型，避免了任何清洁验证，从而节省时间和成本。通过使用小规模的可抛弃型切向流过滤（TFF）方法浓缩质粒和置换溶剂，不需要再使用有机溶剂。
随后，将这种小规模质粒DNA生产方法用于两种质粒的生产：pFAR4-CMV-SB100x-SV40 和pFAR4-ITRs-CMV-PEDF-BGH，其是缺乏抗生素耐受基因的迷你质粒。研究开发了两种质粒的混合液，用于临床试验中视网膜细胞的体外电转。两种质粒在无菌条件下（pFAR4-PEDF，3870bp和pFAR4-SB100x，3094bp）以两个分开的质粒原液独立生产，再以1:16 w/w的比例混合，分装成25μl每瓶，作为最终的患者给药制剂。从该最终制剂，生产了中试和临床批次，确认了生产参数的可重复性和稳定性。最终的药物产品将用于年龄相关黄斑变性患者的临床I期研究。
材料和方法
质粒DNA在无菌条件下生产和制剂，包括两个B级洁净室。一个洁净室专门用于细菌操作（上游工艺），另一个洁净室专用于质粒纯化和终产物的制剂（下游工艺）。两个洁净室均有1个A级生物安全柜，所有关键步骤在安全柜内进行。所有洁净室都进行活性和无活性颗粒监测，包括工作状态和静止状态。整个程序按GMP指南进行。在生产和制剂过程中，仅使用可抛弃型产品。用于质粒生产的缓冲液成分、药物辅料和初级包装材料均为欧盟药典级或由供应商提供质量分析证书（CoA）。所有材料和辅料基于内部质量控制和供应商质量确认获得批准。
pFAR4 SB100x/PEDF生产工艺流程图：A）主细胞库生产；B）质粒药物底物生产；C) pFAR4-CMV-SB100x-SV40/ pFAR4-ITRs-CMV-PEDF-BGH 混合无菌溶液生产（N.A.M.Bakker，et al., 2019）。
详细试验操作，包括质粒设计，主细胞库构建和细菌培养、裂解和预澄清、阴离子交换层析纯化以及制剂等，请参考原文。
浓缩和除菌过滤
使用MWCO 10kD的预灭菌、一次性使用mPES MicroKros切向流过滤（TFF）器组件（P/N C04-E010-05-S）将质粒溶液浓缩至约1mg/mL。操作时，质粒溶液使用无菌注射器压入TFF膜。随后，使用相同的TFF系统，将洗脱缓冲液置换为电转缓冲液，连续置换8个体积。置换后，从TFF系统收集质粒溶液，使用0.2μm过滤器进行除菌过滤。纯化和浓缩过程中进行工艺内控制，并用于质量控制分析。
质量控制实验和分析，包括琼脂糖凝胶电泳、UV分析、毛细管电泳、蛋白质分析、测序、生物负载和内毒素、MCB一致性和纯度、qPCR、剂型均一性、储存稳定性等研究，请参考原文。
讨论
开发的方法不需要使用复杂的生产设备，仅需要使用可抛弃型生产物料，所以实行起来非常简单，并简化了管路清洗，因不需要在线清洗或清洗验证。研究人员使用这种方法成功进行了两种不同质粒的多个小批次生产。生产的质粒，以电转缓冲液制剂，混合并灌装。最终药物产品由1:16 w/w pFAR4-SB100x和pFAR4-PEDF 迷你质粒混合液组成，符合所有规格要求，UV和AGE分析检测呈现高纯度，超螺旋质粒拓扑结构具有一致的高均一性（≥87.7%）。质量控制确认了开发方法的稳健性，稳定性研究显示最终制剂可稳定保存至少两年。最终的患者制剂将用于临床I/II期试验，以对年龄相关性黄斑变性患者的视网膜细胞细胞进行转染。
实验中TFF步骤后的质粒回收率为58%-100%，差异性较大的原因是该工艺手动进行小体积样品操作处理，系统内的相对损失和死体积较高。后期可研究使用设备实现自动化操作，以避免人工误差。但对于本工艺此收率是可接受的，因为该临床工艺仅需要很少量的质粒。
总结来说，所有执行的运行均成功，每次运行的最终药物产品符合质量规格要求，证明了该GMP生产工艺的可重复性。该小规模生产方法可适用于所有其它质粒DNA结构，且可在其它设施中简单地实现。
本文部分内容翻译自原文，由于水平有限，如有不当之处，敬请谅解，详细内容，请参考原文。
原文：N.A.M.Bakker, R.de.Boer, C.Marie, et al., Small-scale GMP production of plasmid DNA using a simplified and fully disposable production method. Journal of Biotechnology, 2019, https://doi.org/10.1016/j.btecx.2019.100007.
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