行业前沿：环状RNA“火了”！一文解析7大生物医学应用、5大热门公司……
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今日，我们为大家带来《医药魔方Pro》的原创文章，不仅编译了上述综述重点介绍circRNA在生物医学领域的应用，并汇总了全球布局circRNA技术的主要玩家，与大家共同探讨circRNA的未来发展。
circRNA是一类闭合环状的RNA分子，主要由mRNA前体（pre-mRNA）通过可变剪接加工产生。早在20世纪70年代，circRNA在病毒内首先被发现，随后在20世纪90年代，学者发现真核生物细胞内的小鼠精子决定基因Sry（sex determining region Y）及人ETS1（ETS proto-oncogene 1）基因可转录生成circRNA。但是，这种低表达量的RNA被认为是剪接错误的产物，并未引起广泛关注。随着RNA测序技术和生物信息学的出现和发展，人们发现RNA在剪接过程中可通过基因重排或反向剪接（back-splicing）形成circRNA，并且这些环状产物在所有转录本中至少占10%。circRNA具有保守性、稳定性和组织特异性。在功能方面，circRNA具有转录调控和蛋白质翻译等功能，参与多种疾病的发生、发展过程。
circRNA一览（来源：Trends in Molecular Medicine）
由于circRNA结构中不具5’端帽子结构与3’端poly A尾巴，缺乏外切酶降解所需游离末端，因此比线性mRNA更稳定；circRNA也不需要进行核苷修饰，避免先天性免疫应答。尽管大多数circRNA不具备表达蛋白能力，但通过合理的结构优化，circRNA的翻译蛋白在表达时间与表达量上均可优于线性mRNA。总的来说，上述特征促使人们尝试基于circRNA开发新型疗法。(相关阅读：小2说丨改写未来药物模式？环状RNA“牛”在哪？)
来源：Laronde官网
circRNA的生物医学应用（来源：Cell）
微小RNA（miRNA）是一类高度保守的单链RNA，与多种生理与病理过程有关，通过与mRNA的3’UTR结合，负调控mRNA表达。表达miRNA结合位点的circRNA可以吸附miRNA，抑制miRNA活性，解除miRNA对特定基因的沉默效果。由于circRNA的序列、长度不同，其结合的miRNA数量和种类也各不相同。目前，对表达量有限的环状RNA在细胞中是否真的行使miRNA海绵的功能，领域内尚有一些争议。
miRNA-122在肝脏中表达，可以与丙肝病毒（HCV）RNA 5’端2个位点结合，保护其免受外切降解，增强其在肝细胞中的复制与翻译。Miravirsen是第一个进入临床的靶向miRNA的药物，是锁核酸修饰的寡核苷酸，与miRNA-122互补，可治疗慢性丙肝，但目前临床II期试验已停止进一步开发。Jost等人在2018年报道了一种含有4个miRNA-122结合位点的circRNA海绵，阻断病毒蛋白生成效率较Miravirsen更高。
Annadoray Lavenniah等人设计的环状miRNA海绵（circmiR）在主动脉弓缩窄（TAC）小鼠模型中取得了良好的效果。研究表明，miR-212/132表达上调将激活心肌病理性肥大。实验中，研究人员利用腺相关病毒（AAV）将circmiR靶向递送至TAC小鼠心肌细胞，这种circmiR含有6个miR-132和6个miR-122结合位点，可有效降低心肌肥厚症状。
越来越多的证据表明，在细胞质中表达的circRNA可以与蛋白质结合，抑制这类蛋白质向细胞核转运。将RNA结合蛋白质类（RBP）结合位点融入circRNA序列中，可实现circRNA蛋白海绵功能。这一过程可通过指数富集的配体系统进化（SELEX）以及交联和免疫沉淀（CLIP）技术实现。
例如，核不均一核糖核蛋白L（hnRNP L）是一种RNA剪接调控因子，可与mRNA前体中短CA重复序列结合。T4 RNA连接酶来源的含有20~100个CA二核苷酸重复序列circRNA及含有相同CA重复序列的异位表达circRNA对异质性hnRNP L具有较高的亲和力。结果表明，定位在细胞质中的含有CA二核苷酸重复序列的circRNA显著降低了hnRNP L水平，其效果类似于由siRNA介导的hnRNP L耗竭。
类似于miRNA海绵与蛋白海绵，将circRNA开发成稳定的反义RNA很有吸引力。通过靶向SARS-CoV-2基因组RNA的5’UTR区开发的系列反义环状RNA，可以在细胞层面抑制SARS-CoV-2增殖，具有强大的耐用性。长期以来，反义策略一直是调节RNA稳定性、结构、活性的有效手段，通常是通过2’-OMe/2’-MOE或锁核酸修饰，提高RNA碱基配对或稳定性的ASO。将反义序列插入circRNA骨架可抑制约90%病毒增殖，而与2’-OMe/2’-MOE修饰的ASO相比，未修饰的反义circRNA稳定性更好，因而具有更强的活性。
T4 RNA连接酶和I型内含子（permuted group I introns）是制备circRNA的有效手段。然而，这2种方法生成的circRNA的免疫原性不同。由T4 RNA连接酶产生的circRNA免疫原性可忽略不计，而T4噬菌体胸苷酸合成酶基因I型内含子序列（td）产生的circRNA可通过模式识别受体维甲酸诱导基因-I（RIG-I）在细胞和小鼠模型中诱发免疫反应。导致这种现象的部分原因是circRNA缺乏m6A修饰，而这种修饰是细胞识别“自身”RNA，避免细胞免疫反应的关键。除此之外，td来源的circRNA还可激活PKR信号通路，尽管激活程度与双链RNA相比更低。因此，外源性引入td来源的circRNA可能激活免疫反应。
系统性红斑狼疮（SLE）、慢性炎症性皮肤病等自身免疫疾病患者体内内源性circRNA表达整体下调。SLE来源的T细胞和外周血单个核细胞中含有16-26 bp dsRNAs的circRNA异位表达减弱了异常PKR激活和IFN-β诱导的SLE特征基因。更重要的是，由T4 RNA连接酶产生的circRNA免疫原性非常低，这种含有短双链RNA域的300-500 nt的circRNA在细胞和体外对PKR活化的抑制能力是PKR小分子抑制剂的1000倍以上。考虑到含有双链RNA的circRNA还可以与其他与先天性免疫相关的dsRBP结合，它们可能会作为参与抗病毒活动的其他dsRBP的抑制剂。因此，这些结果表明，无免疫原性的circRNA在病理条件下不会过度激活PKR，具有潜在的治疗效果，但还需要活体实验进一步验证。
真核细胞蛋白质的合成主要通过mRNA的帽依赖性翻译途径，这类翻译方式利用mRNA的5’帽结构来招募翻译起始复合体进而启动蛋白质合成。细胞内还存在着另外一套不依赖于5’帽结构的翻译方式，它可以通过内部核糖体进入位点序列（IRES）等调控元件启动非帽依赖性翻译。由于circRNA没有游离的5’端，不能进行帽依赖性翻译，因此曾被认为是非编码RNA。但是，近几年体外和体内的研究发现部分circRNA可通过非帽依赖性的翻译机制生成蛋白质。研究表明，circRNA分子可以在IRES帮助下募集翻译起始因子从而起始蛋白质的翻译（下图a）；circRNA上的甲基化修饰m6A，也可以像IRES一样驱动circRNA翻译合成蛋白质（下图b）；此外，circRNA还可以利用其他的序列元件（如：IRES-like elements）来启动非帽依赖性翻译。
circRNA非帽依赖性蛋白质翻译机制（来源：Wiley Interdiscip Rev RNA.）
由于circRNA出色的稳定性，circRNA是解决mRNA药物不稳定问题的有效策略。与线性RNA相比，通过纳米制剂递送的未修饰的、含有IRES的circRNA在细胞与小鼠脂肪组织中的翻译持续时间更久。最近，用于预防SARS-CoV-2、编码Spike蛋白的circRNA疫苗结果表明，这种疫苗在抗原生成、中和抗体表达、Th1型免疫应答水平更强。这些研究表明，circRNA可具有延长抗原表达的潜力。然而，仍有一些问题需要解决，包括进一步提高circRNA生产和递送能力，优化IRES和其他介导不依赖帽子结构的翻译手段，减少由circRNA本身引发的细胞免疫。
研究表明，circRNA病理表达变化与自身免疫性疾病、阿尔茨海默症、前列腺癌、结直肠癌、白血病等疾病有关。例如，前列腺癌患者的circRNA在细胞内外（包括血液、血浆、细胞外囊泡、唾液、尿液）稳定性异常表明了circRNA作为诊断生物标志物的潜力，尤其与纳米孔测序联合使用时，可以进一步鉴别circRNA亚型。
布局circRNA领域的公司
根据公开资料，目前已有几家公司布局circRNA疗法的开发，但研发进度多处于临床前早期阶段，产品管线多布局于circRNA的体内编码蛋白领域。
来源：Laronde官网
Laronde将circRNA命名为eRNA（endless RNA）,公司于2017年由Flagship Pioneering孵化建立。Laronde通过引入IRES序列启动eRNA的蛋白翻译过程；通过替换编码蛋白序列，eRNA具有表达任意类型的蛋白质的潜力，这种模块化的设计策略有望使其应用于多种类型的疾病。
模块化设计的eRNA（来源：Laronde官网）
Laronde联合创始人和董事会成员Avak Kahvejian博士表示，Laronde将推进eRNA的科学研发，通过不同递送技术（如皮下给药）在体内合成分泌肽、蛋白质、抗体、疫苗。相较于mRNA技术，eRNA没有游离端，不被免疫系统识别，并且非常稳定，能够长时间表达蛋白质。此前，Laronde分别于2021年5月10日与2021年8月30日完成了5000万美元的A轮融资以及4.4亿美元的B轮融资。
来源：Orna Therapeutics官网
由Alex Wesselhoeft博士、Raffaella Squilloni和Dan Anderson教授共同创立，经MPM Capital孵化的Orna Therapeutics成立于2019年，该公司将circRNA命名为oRNA。Orna的研发策略是通过oRNA结合递送系统创新RNA疗法。2021年2月，Orna完成了由MPM Capital、Taiho Ventures和F2 Ventures领投的8000万美元A轮融资。oRNA技术可以将线性RNA自催化环化形成环状RNA，生产简便、蛋白表达增大，免疫原性低。通过专有的LNP递送技术，将血清蛋白吸附在LNP表面，帮助oRNA-LNP复合物递送至靶细胞。oRNA结构中引入了IRES序列，启动circRNA与核糖体的结合及蛋白质翻译过程。
oRNA技术（来源：Orna Therapeutics官网）
Orna Therapeutics在肿瘤、遗传病、新冠肺炎等领域都有布局，各产品都处于早期研究阶段。领先项目ORN-101基于oRNA与专有LNP技术开发，这种原位CAR疗法可以在患者体内产生修饰的免疫细胞，患者无需清淋，易于重复给药，有望突破现有CAR-T疗法的困境。
Orna 产品管线（来源：Orna官网）
来源：圆因生物官网
圆因生物成立于2021年4月，由北京大学生命科学学院魏文胜教授创立，专注于circRNA在创新药物和创新疗法领域的研究和应用，建立丰富的预防性和治疗性新药产品管线，致力于解决临床上未被满足的疾病需求。
6月21日，圆因生物宣布顺利完成超过2.8亿元人民币A轮融资。本次融资由某知名产业投资机构与和玉资本联合领投，夏尔巴投资与三正健康投资跟投。公司此前已完成天使轮及Pre-A轮融资，三轮融资金额累计超4亿元人民币。
尽管圆因生物尚未公布具体的产品管线，近日，魏文胜教授团队报道利用circRNA疫苗技术平台开发了针对SARS-CoV-2及其系列变异株的circRNA疫苗，研究结果表明，针对德尔塔变异株研制的circRNA疫苗（CircRNARBD-Delta）对多种变异株具有广谱保护效果。相关结果于3月31日发表在Cell杂志上。
CircRNARBD-Delta疫苗作用（来源：Cell）
CircRNARBD-Delta疫苗编码新冠病毒刺突蛋白（Spike）受体结构域（RBD），产生中和抗体，诱发强烈的T细胞反应，在小鼠与恒河猴中可提供针对SARS-COV-2的强大保护。与N1-甲基假尿嘧啶（1mΨ）修饰的mRNA疫苗相比，1）circRNA疫苗稳定性更高，提供了表达更多、持续更长的抗原；2）circRNA疫苗诱导机体产生的中和抗体水平更高，对多种突变株有效，降低潜在的抗体依赖增强症（ADE）不良反应；3）circRNA疫苗诱导更高比例的IgG2/IgG1，诱导Th1保护型T细胞免疫反应，降低疫苗相关性呼吸道疾病的风险。
来源：环码生物官网
环码生物成立于2021年6月，是一家专注于环状RNA核酸药物开发的创新型生物科技公司，先前已完成由凯泰资本和杏泽资本共同领投的千万美元级别天使轮融资，以及由险峰旗云领投，昆仑资本、倚锋资本和天使轮股东凯泰资本跟投的2000万美元Pre-A轮融资。公司致力于利用自主研发的环状RNA技术平台，开发传染病疫苗、个性化肿瘤疫苗、蛋白替换疗法以及免疫疗法，打造基于环状RNA系统的全球领先的药物开发平台。
环码生物由科学创始人王泽峰教授与共同创始人、首席技术官杨赟博士等共同建立，两位科学家在circRNA领域都有多年研究经验，在国际上首先发现了circRNA在细胞内的翻译功能。近日，环码生物公开了自主开发的基于group II intron的RNA环化方法。目前，公司也尚未公布具体产品管线。
杨赟博士表示，作为国内环状RNA疗法领域的开拓者，环码生物具有独特的从头设计和优化翻译元件的方法，独有的高效RNA环化技术。作为技术平台公司，环码生物现阶段正在不断丰富自己的平台（差异化的翻译元件和新的递送系统）并优化生产工艺以适应高通量大规模的环状RNA制备。环码生物现阶段将以疫苗和蛋白替代疗法两个方向验证环状RNA在疫苗和蛋白替代或过表达中的效果。未来将基于验证结果多管线并行开发不同的RNA药物。
来源：Chimerna Therapeutics官网
不同于大多数企业利用circRNA编码蛋白，Chimerna的技术独具特色。为了维持细胞内足量RNA水平、减少给药次数，Chimerna的开发策略是利用脂质纳米粒或腺相关病毒将DNA递送至靶细胞，在细胞内转录称线性RNA，随后环化形成稳定的circRNA。这些circRNA可以与目标蛋白结合，发挥适配体（apatmer）功能。适配体是依靠RNA核苷酸序列的碱基配对，折叠形成的特殊结构，与靶蛋白以高度特异性结合，从而调控蛋白功能。
Chimerna的circRNA环化技术（来源：Chimerna）
小分子药物与蛋白结合过程往往依赖蛋白结构中的结合口袋，而绝大多数蛋白缺乏此类结合位点，因而被称为“不可成药”。适配体可以折叠与蛋白表面的任意位点结合，是缺乏结合口袋蛋白的理想配体。此外，适配体出色的特异性赋予其识别野生型与突变蛋白、单体与聚合物的能力。
适配体的结合特性（来源：Chimerna官网）
根据公布的产品管线，Chimerna在常染色体显性遗传性疾病和神经退行性疾病共有3款药物处于药物发现阶段。
Chimerna产品管线（来源：Chimerna Therapeutics官网）