行业洞见丨新方法或将改变mRNA制备工艺，高效去除IVT副产物dsRNA

8月21日，国际学术期刊Molecular Therapy-Nucleic Acids正式在线发表了朴希俊博士等科学家的研究成果“Double-stranded RNA reduction by chaotropic agents during in vitro transcription of messenger RNA”，通过离散剂有效去除IVT副产物dsRNA，提升mRNA制备工艺。

目前，朴希俊博士已加盟楷拓生物，一家专注新技术领域CDMO服务的创新科技公司，领导mRNA工艺开发团队。公司团队已突破多项技术难点，可以为国内外mRNA疫苗和药物研发提供多种不同级别和工艺路线的mRNA原液并进行放大生产，助力基因治疗与核酸药物领域的加速发展。

为了快速有效抗击COVID-19大流行，mRNA疫苗被紧急授权接种保护易感人群建立全球免疫屏障。这也催生了mRNA技术研发浪潮，促进了新一代疗法的医学革命，除疫苗外，mRNA技术在肿瘤治疗、罕见病治疗、基因编辑、蛋白补充疗法、传染病预防、免疫治疗等领域有着广泛应用。目前，全球累计已有150种以上mRNA疫苗和药物研发管线。

mRNA疫苗和药物研发的技术门槛，除核心壁垒递送技术，体外合成mRNA的纯度也十分关键。mRNA合成过程中产生的副产物dsRNA杂质（double-stranded RNA，双链RNA），会刺激RIG-I和MDA5等，触发下游抗病毒天然免疫信号通路，引起免疫反应。作为治疗用药，数十毫克剂量的mRNA，一旦杂质质量控制出现问题，注射入体内后，病人可能出现强烈的不良反应，甚至是生命危险，mRNA合成纯化质控过程至关重要。

现有去除dsRNA两类方法

一、体外转录后去除dsRNA

1.RP-HPLC和羟基磷灰石色谱法，这两种纯化方法也是目前最常用的纯化mRNA原液的方法，这种纯化方式存在以下问题：a）由于柱负载能力有限而导致规模放大困难，产能限制；b）纯化过程中的高温和外力作用影响了mRNA的完整性；c) RP-HPLC工艺中用到的大量有机溶剂也有生产安全隐患。

2.纤维素粉吸附dsRNA的纯化方法，同样面临规模放大困难产能有限的问题，同时mRNA的完整性会有一定程度的降低。

3.RNase III消化长片段dsRNA的方法有误伤mRNA本身二级结构的风险，同时增加提纯成本。

以上方法来看，转录后纯化去除dsRNA会增加制造成本，降低产量，而且通常会降低mRNA的完整性，尤其是较长的mRNA。因此，很多科学家的目光转向了体外转录过程中减少dsRNA副产物的方法。

二、体外转录过程中纯化去除dsRNA

1.降低Mg2+浓度，有实验结果证明当Mg2+浓度为5mM时，几乎检测不到dsRNA的存在。但是，这也严重影响了mRNA的产量，因为Mg2+是RNA聚合酶必备的辅助因子。

2.高温方法减少IVT过程中dsRNA的形成。考虑到mRNA的大规模生产，高温对设备的要求极高且会带来巨大的经济负担。

朴希俊博士及其美国团队在Molecular Therapy-Nucleic Acids上发表文章《Double-stranded RNA reduction by chaotropic agents during in vitro transcription of messenger RNA》，公开了一种简单、高效、低成本、规模化去除IVT反应副产物dsRNA的方法。

dsRNA 副产物的形成机制

目前业内一致认可dsRNA副产物主要通过两种不同的机制发生。第一种机制基于T7 RNA聚合酶本身具有的RdRp活性^（1），能够以产物RNA为模板，3'末端继续延伸RNA后与原RNA分子反向互补配对形成发卡结构（图1A）；或者是在转录过程中，随机断裂的/不完整的转录产物与mRNA互补配对从而延伸成不完整的双链RNA（图1B）。第二种机制假定以DNA反义链为模板，独立于启动子的转录过程形成dsRNA（图1C）。

（1）RdRp活性（RNA-dependent RNA polymerase）：RNA依赖性RNA聚合酶活性图1. mRNA中dsRNA的形成机制

基于以上两种机制，作者提出假设“减弱这类有助于dsRNA形成的碱基互补配对进而减少IVT过程中 dsRNA的形成”。为了验证这一假设，作者在IVT反应中加入了不同浓度的离散剂（chaotropic agent），创建一个温和的离散环境，在该环境中会破坏RNA碱基互补配对，但RNA聚合酶功能完整。作者评估了加入离散剂后IVT副产物dsRNA产量变化、免疫原性强弱以及蛋白质翻译效率的影响。

离散剂能有效减少

dsRNA形成

本文利用抗双链RNA单抗-J2抗体，通过斑点印记（Dot blot）来检测mRNA样本中dsRNA含量。作者选用了5000nt长度的mRNA作为样本，测试了包括尿素、甲酰胺等在内的离散剂不同浓度条件下对mRNA产物中dsRNA含量的影响。260nm的紫外分光光度计评估mRNA产量。

实验结果显示，较高浓度的尿素和甲酰胺能够有效减少dsRNA形成，且对IVT生成的mRNA产量仅产生轻微影响，这表明一定浓度范围的离散剂不会影响T7 RNA聚合酶的效率。如图2所示，随着尿素和甲酰胺浓度升高，dsRNA含量减少明显，在较高浓度时（如0.8M尿素或1.6M的甲酰胺）时，dsRNA含量接近HPLC纯化后的结果。

图2. 尿素和甲酰胺浓度对IVT反应中mRNA产量和dsRNA形成的影响不同IVT反应条件下，离散剂是否都能起到减少dsRNA含量的作用呢？答案是肯定的，作者评估了修饰碱基（甲基假尿苷）和非修饰碱基、5‘加帽法以及带有不同长度polyA尾等IVT条件下的dsRNA含量变化，如图3所示，结果良好。
图3. 不同修饰碱基下离散剂对IVT副产物dsRNA产量的影响

不同时间点

加入离散剂的影响

作者还做了一个有趣的实验，分别于五个时间点将8M尿素添加到五组IVT反应体系中，终浓度皆达到1M。从图4能看到，越早添加尿素IVT副产物dsRNA含量越小，这一结果说明尿素无法破坏已形成的双链RNA，仅能阻止双链RNA形成过程中碱基配对从而减少dsRNA的形成。

图4. Dot blot结果显示延迟添加尿素会增加dsRNA副产物含量

去除dsRNA

提升mRNA翻译效率

作者准备了3组样本：mRNA1（IVT反应体系未添尿素）、mRNA2（IVT反应体系添加1.2M的尿素）和HPLC（IVT后HPLC纯化去除dsRNA方式），分别转染HepG2细胞系，利用in-cell Western Blot检测三组样本中蛋白表达量。从图5中可以看到，蛋白表达量最好的是mRNA2样本，mRNA1次之，比mRNA2少了20%，翻译效率最差的是HPLC纯化后的mRNA样本，这可能是因为HPLC过程中过高的温度或其他条件造成mRNA部分降解（图5A，第三泳道）。结果表明，尿素可以有效去除dsRNA提升mRNA翻译效率。作者提到一种可能的解释是，dsRNA诱导激活蛋白激酶R（PKR），通过磷酸化翻译抑制始因子eIF2α抑制mRNA的翻译。图5. 评估mRNA 完整性评估、dsRNA含量、蛋白表达情况及mRNA1、mRNA2和HPLC mRNA的免疫原性

去除dsRNA

降低mRNA免疫原性

为了检测三组样品mRNA1、mRNA2和HPLC mRNA的免疫原性，各自转入了不同的THP1-Dual细胞系。这个细胞系表达两种基因结构，一种是Interferon-promoter luciferase系统，dsRNA激活抗病毒信号途径后上调干扰素的表达（IFNs），诱导IFN启动子表达luciferase；一种是核因子κB（NF-κB）-诱导分泌型碱性磷酸酶（SEAP）基因，在IFN的刺激下，MDA5蛋白（识别dsRNA的蛋白）的下游基因也被激活引发炎症反应，炎症条件下NF-κB诱导SEAP基因表达产生luciferase底物。Luciferase和其底物反应后荧光素发光，这样THP1-Dual可以检测到由ssRNA和dsRNA触发的免疫反应。
如作者所设想，mRNA1组免疫原性最高，因为mRNA1中有较高含量的IVT副产物dsRNA，而mRNA2和HPLC组的mRNA免疫原性显著降低（图5B、5D）。结果表明尿素可以有效去除IVT过程中副产物中dsRNA，进而降低mRNA免疫原性。

结语

mRNA药物方兴未艾，未来行业发展还需持续优化工艺流程、建立完整的质量监管体系。mRNA疫苗和药物的研发还有诸多技术门槛，有效去除IVT反应副产物dsRNA有助于提高mRNA的表达效率、协助降低mRNA非特异免疫原性。
文章第一作者朴希俊在美国攻读博士学位和博士后研究阶段，分别从事非天然碱基识别配对和RNA纳米粒子的自组装的研究工作，随后在罕见病创新药研发公司从事mRNA的工艺开发工作，面对dsRNA的去除难题，他凭借丰富的学术和产业经验联想到离散剂。离散剂，如尿素和甲酰胺，长期以来被用于凝胶电泳或其他生物分析技术，可以使核酸和蛋白质这样的大分子变性。幸运的是，dsRNA形成过程中的碱基配对相对更弱。因此，作者假设IVT反应在温和的离散环境中能够减弱不必要的碱基配对，从而减少dsRNA的形成，同时保证聚合酶保真性，合成具有相同较高产量和正确序列的mRNA产物。
作者团队成功了，这样一种简单、有效、经济、可放大生产的方法可以有效调控和减少双链RNA杂质的产生。对于mRNA疫苗来说，dsRNA可能有佐剂的效果，故用此方法能够调控佐剂含量，有助于调控保护效力。对于mRNA药物来说，双链RNA杂质有非特异免疫原性，可引起强烈的免疫反应，一方面危害健康，一方面减少蛋白表达，而此方法可以有效减少dsRNA同时不降低mRNA完整性和产率，是理想的mRNA药物生产工艺，未来有望得到广泛使用。作者团队也申请了相关专利。

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