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疫苗概述
疫苗在疾病预防中扮演着重要的角色，而疫苗接种的功效早已超出了预防，治疗性疫苗也进入到后期临床试验阶段。疫苗技术也从使用灭活及减毒病原体、发展到使用仅包含可触发免疫反应的病原体成分的亚单位。常用的疫苗包括类病毒颗粒疫苗、重组病毒载体疫苗以及类毒素疫苗、多糖疫苗或蛋白疫苗。
mRNA疫苗的优势
传统的减毒和灭活疫苗、类毒素疫苗和亚单位疫苗、病毒载体和DNA技术或因研发周期长、或因安全性风险等原因，限制了其应对突发公共安全事件。
mRNA具有一些独特的技术优势，使其非常有希望成为传统疫苗甚至DNA疫苗的替代品；首先，mRNA只表达特定抗原并定向诱导免疫反应，与DNA疫苗相比，mRNA更安全有效，因为表达不需要进入细胞核，随机基因组整合的概率几乎为零；其次，由于mRNA生产是基于体外无细胞转录反应系统，因此无其他疫苗生产中常见的细胞来源杂质和病毒污染物等安全性风险；另外，mRNA疫苗编码不同抗原不会影响mRNA主体结构的理化学性质，有利于采用标准化生产。
mRNA疫苗的结构
mRNA疫苗的结构类似于真核mRNA，一个单链分子在5’端有一个帽子结构（Cap），在3’端有一个Poly A尾，开放阅读框（即图三中感兴趣的基因GOI）两侧各有一个非翻译区（UTR）。
5’Cap与真核生物翻译起始因子（eIF4E）结合来启动翻译，使其免遭核酸外切酶的降解，还可促使mRNA环化形成空间及结构，增强稳定性。甲基化程度不同可形成3种类型的帽子：CAP 0型、Cap 1型和Cap 2型。
3’UTR尾部是一段Poly A序列，与帽子结构类似，Poly A尾也能起到保护mRNA防止被核酸外切酶降解，Poly A也参与到翻译及其调控过程中，可与多聚腺苷酸结合蛋白（PABP）结合形成环状复合物，参与翻译的起始过程。非翻译区（UTR）影响转录调控和mRNA稳定性，这些区域强烈影响翻译效率。
5’Cap、Poly A尾巴及编码序列两侧的5’和3’UTR元件深刻影响mRNA的稳定性和翻译，这些都是疫苗的关键问题。通过工程化改造mRNA疫苗可大大增加其稳定性及免疫效力。如引入非天然核苷（NTPs），以及通过密码子优化提高翻译效率，也常用于mRNA疫苗。辉瑞/BioNTech的mRNA疫苗BNT162b2和Moderna的mRNA-1273利用了核苷修饰技术，用假尿苷替换尿苷。而CureVac的mRNA疫苗CVnCoV使用未经修饰的天然mRNA，通过其RNActive 平台改变mRNA序列并优化密码子，以提高mRNA的稳定性和免疫原性。
mRNA生产
与传统疫苗相比，mRNA最重要的优势之一是其相对简单的制造。mRNA疫苗生产可分为上游加工（包括酶促反应生成初级mRNA）和下游加工（包括纯化mRNA）。
上游工艺
转录：上游主要是以质粒为模板在T7、SP6或T3 RNA聚合酶的作用下转录成初级mRNA，该反应只需要几个小时，通常，每毫升反应可获得毫克级的初始mRNA。
加帽：可以在转录反应期间通过使用Cap类似物替代三磷酸鸟苷（GTP）底物来实现，或者，可以使用牛痘加帽酶（VCC）和甲基供体作为底物进行二次酶反应来加帽。相比使用Cap类似物加帽（60–80%），二次酶催化的加帽率更高（可达100%），但cap类似物加帽工艺更快。在大规模制造的情况下，由于价格的原因，Cap类似物可能会增加生产成本。
下游工艺
上游产生的mRNA需通过多个纯化步骤从反应混合物中分离和纯化，以达到临床质量要求（反应混合物不仅包含所需mRNA，还包含许多杂质，如酶、残余NTP和DNA模板，以及转录期间形成的异常mRNA（如ds mRNA）。
色谱是制药行业广泛使用的一种纯化方法，离子交换色谱法（IEC）可用于大规模纯化mRNA，弱阴离子交换色谱法已成功用于mRNA的纯化。
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