乘干细胞之东风——火爆“外泌体”的崛起
点击上方蓝色小字↑↑↑------“干细胞者说”，加星标，长期关注本科普号。
静下心来
潜心研究
我们将走的更远
传说中的外泌体是何方神圣？如何看待“外泌体在临床医学的应用”？今天，我们请泡泡先生跟大家聊一聊！
撰文：泡泡先生
修订：步步先生
来源：干细胞者说
随着间充质干细胞（MSCs）培养技术的推广，外泌体作为高科技概念产品迅速风靡细胞治疗和药妆行业。当然，你听到的这些应用只是外泌体应用的冰山之一角。
今天我们就来聊一聊外泌体这个时髦的名词。
风靡市场的外泌体相关产品
其实，说起外泌体也是鼎鼎大名的，可以说也是诺奖级的。2013年的诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家詹姆斯·罗思曼、兰迪·谢克曼以及德国科学家托马斯·祖德霍夫，以表彰他们发现细胞的囊泡运输调控机制。外泌体就是囊泡的其中一种。
一句话概括就是：外泌体就是一部货拉拉，装了自家一堆乱七八糟的东西（里面有miRNA，mRNA和lncRNA，还有细胞因子，或许还有点DNA），然后分泌出细胞外，再接着进入另一个细胞，卸车完事。
1
外泌体是何方神圣？
外泌体（exosome）是一类直径30-150nm，具有完整膜结构的细胞外囊泡，主要负责细胞间的物质运输和信息传递。
1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现， 1987年，Johnstone将其命名为"exosome"。起源于细胞内吞过程中形成的内体，最后再从细胞中释放到胞外。
作为细胞间的一种通讯方式，多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，例如细胞培养液、血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中 。
外泌体的电镜照片
外泌体的电镜是鉴定外泌体形态大小的一个常规手段，电镜下呈典型的杯状形态。细胞外囊泡 (extracellular vesicles, EVs)是机体远距离细胞间交流的一种手段。目前主要被分为3大类：外泌体、微囊泡和凋亡小体，临床研究中主要关注的是外泌体。外泌体（直径30~150nm，富含RNA和蛋白质），再大的就属于微囊泡（直径100~350nm，富含金属蛋白酶和磷脂酰丝氨酸），再大就是凋亡小体（500~1000nm，富含组蛋白）了，由细胞凋亡产生。
外泌体、微泡、凋亡小体三姐妹
2
外泌体的生物学效应和分离方法
外泌体发挥生物学效应的方式有哪里呢？主要有以下两种：
（1）直接作用。外泌体表面的蛋白分子或脂质配体直接激活靶细胞表面的受体，产生信号复合体并激活胞内信号通路；
（2）递送作用。外泌体可以与靶细胞的质膜融合或内吞直接进入细胞，将自身携带的蛋白质、核酸、脂质等活性分子带到细胞内，进而调控细胞的功能及生物学行为。
外泌体发挥生物学效应的方式（以MSCs为例）
超速离心法是分离外泌体的标准方法。在4℃条件下依次以300G，2000G，10000G的转速离心，依次去除细胞和细胞碎片等，再以100000G超速离心得到外泌体。但离心法每次处理的样本量较小，而且反复高速离心会导致外泌体破裂影响质量。可根据外泌体密度使用连续梯度蔗糖密度梯度离心法，蔗糖对细胞无毒，粘度不高且pH中性，所获外泌体纯度高，但含有难以去除的高密度化学物，不适合临床应用。超滤法用孔径小于100nm的超滤膜短时间低速离心就可以分离得到外泌体，但超滤时施加的压力比较大，导致体积大的囊泡变形和破裂。
超速离心法分离外泌体
我们也可通过CD63等外泌体特异性蛋白的抗体精准分离。另外，基于聚乙二醇（PEG6000）等聚合物沉淀的方法也被用于分离外泌体。也有研究人员将微流控技术和声学巧妙结合形成声流体装置，首先，利用较低频率（19.6 MHz）声波去除血液中尺寸较大的红细胞、白细胞以及血小板等；然后采用较高频率（39.4 MHz）的声波将外泌体与细胞外囊泡亚组成分（凋亡小体、较大的细胞外囊泡等）进行分离，并在通道的指定出口对外泌体进行收集。
3
外泌体用于组织修复再生
由外泌体介导的递送具有以下几个优点：1、具有高度生物相容性，如果它们来自适当的细胞（例如间充质干细胞（MSCs）或未成熟的DC），则同时具备免疫惰性；2、能够穿越人体厚实的组织屏障，如血脑屏障（BBB）等。正常情况下，外泌体可以直接用作和免疫调节的潜在治疗剂。
虽然说，干细胞外泌体成为研究热点可能得益于干细胞研究的蓬勃发展，但干细胞外泌体确实有诸多优势。
免疫原性低。外泌体比细胞具有更低的免疫原性。更容易地开发“货架”产品。
易保存。外泌体在-20°C下储存6个月，-80°C长期保存，同时不会损失其生化活性。
稳定。外泌体可保护其内容物免于降解，从而防止某些活性成分快速降解。
可量产。外泌体可在培养基内大量富集。
可控制。外泌体功能可通过改变细胞环境来改变。
MSCs外泌体具有免疫调节、抗炎和抗纤维化、抑制氧化应激、增强血管生成等作用。这主要依赖于其中的蛋白和核酸组分。例如MSCs外泌体富含糖酵解相关酶，可增加ATP的产生，减少组织细胞死亡。MSCs外泌体还含有VEGF、TGF-β1、IL-6、IL-10和HGF等细胞因子，有利于血管生成和免疫调节。2018年4月，FDA批准了Aegle公司的首个细胞外囊泡新药（IND）申请，以开始用于烧伤患者的临床试验。该公司通过分离纯化MSCs分泌的细胞外囊泡，用以治疗严重的皮肤病，包括烧伤和大疱性表皮松解症。
外泌体可以促进皮肤创面愈合：促进创面局部巨噬细胞从促炎M1向抑炎M2型转变从而有助于组织修复，抑制肌成纤维细胞分化和过度纤维化，从而减少瘢痕形成。有研究表明，人脂肪干细胞（ADSCs）来源的外泌体，含有丰富的miRNA-125A和miRNA-31，可显著促进血管生成。而人羊膜上皮细胞来源外泌体，通过刺激基质金属蛋白酶1（MMP1）的表达来调控细胞外基质沉积，从而促进创面愈合。MSCs外泌体，也可用于调控系统红斑狼疮所致的骨质疏松的BMSCs功能，增加骨密度促进骨再生。
外泌体中的miRNA，可以调控基因表达，其比例比细胞更高，例如miR-155、let-7f、miR-199a、miR-221、miR-125b-5p和miR-22等等，参与多种生理和病理过程。例如外泌体释放的miR-125b-5p就有助于改善心肌梗死区功能。
4
外泌体用于肿瘤诊断和治疗
肿瘤细胞的外泌体，含有大量与肿瘤相关的核酸和蛋白，在癌症发生和早期检测中具有重要的研究和应用价值。例如通过使用49种抗体来检测来自431位肺癌患者和150位健康个体的外泌体蛋白发现，与健康个体相比，CD171和CD151在患者中高度表达，而外泌体CD151可作为检测小细胞肺癌的标志物。
外泌体内容物作为肿瘤的潜在诊断标志物（数据来源：中华检验医学杂志）
寄生虫也可以，通过分泌外泌体将生物活性物质转移到宿主细胞中，调控宿主免疫，介导寄生虫的免疫逃逸。例如疟原虫、锥虫、血吸虫和弓形虫等均可以通过外泌体影响宿主免疫。
树突细胞外泌体，可激活肿瘤特异性细胞毒性Ｔ淋巴细胞反应并抑制体内肿瘤生长，有关树突细胞外泌体应用的多种临床试验的开展，显示出其作为治疗方法应用的巨大潜力，但树突细胞外泌体表面PD-L1过表达限制其疗效，而基于树突细胞外泌体联合疗法如与PD-1/PD-L1中和抗体的联合应用，为树突细胞外泌体抗肿瘤治疗提供了新路径。
5
如何看待外泌体的成药性
由于外泌体具有体积小、容易穿过细胞膜和免疫原性低等优点，可以作为药物的良好载体。外泌体结构较稳定，可以应对不良理化环境。
基于外泌体开发和应用的部分企业（图：干细胞者说制）
目前，许多基于外泌体的I/II期临床试验正在进行。不同来源的外泌体，在体内显示不同的归巢能力，这可能是与其膜表面受体和细胞外基质结合蛋白有关。静脉注射是基于外泌体递送药物中使用最为广泛的给药途径。腹腔注射、瘤内注射、口服和鼻腔给药也在多种疾病模型中得到了尝试。静脉注射外泌体24h后，肝脏中荧光信号最强，其次是脾脏、胃肠道和肺部。
因此，外泌体注射后的分布，以及长期的影响和安全性，仍将需要进一步探索和阐明。
外泌体载药可以分为三种：外源性载药、内源性载药和转基因。
外源性载药方式：先分离外泌体，再将药物通过转染或电穿孔导入外泌体；
内源性载药方式：先将药物导入细胞中，当药物进入外泌体且从供体细胞中释放后，分离纯化得到载药外泌体；
转基因方式：通过转基因的方式让细胞自身表达，最终随外泌体分泌至细胞外。
外泌体规模化应用开发关键在于两点：一是依赖于细胞培养条件的提升，3D培养是一个方向。二是依赖于外泌体分离纯化方法的提升，滤膜分离是一个方向。哺乳动物细胞释放的外泌体较少，产量不高，可依次通过10μm、5μm和1μm的聚碳酸酯膜挤出外泌体-模拟纳米囊泡，通过富集，产量比天然外泌体高出100倍以上，产量高且易于纯化，为外泌体规模化应用于临床提供了可能。
近几年，关于外泌体的研究文章数量呈井喷式发展，无论是提取制备工艺还是作为一种治疗制剂和药物，或者作为疾病的新型诊断标志物，都有了长足的发展。外泌体有希望成为人们通向健康大门的桥梁。
参考文献（部分）
1.Exosomes: composition, biogenesis and function." Nat Rev Immunol 2(8): 569-579.2002
2.Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol 200(4): 373-383.2013
3.Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities." Nat Rev Drug Discov 12(5): 347-357.2013
4.Human umbilical cord mesenchymal stem cells and exosomes: bioactive ways of tissue injury repair[J].Am J Transl Res. 11(3): 1230–1240.2019;
作者简介：
泡泡先生，国内知名三甲医院副教授，兴趣广泛，爱好众多。关注细胞治疗、外泌体、3D打印，生物材料等和细胞相关的一切。泡泡科普：
— END —
干细胞者说
- 科普 情怀 责任 -