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乘干细胞之东风——火爆“外泌体”的崛起

泡泡先生 干细胞者说 2022-07-07

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传说中的外泌体是何方神圣?如何看待“外泌体在临床医学的应用”?今天,我们请泡泡先生跟大家聊一聊!

撰文:泡泡先生

修订:步步先生

来源:干细胞者说

随着间充质干细胞(MSCs)培养技术的推广,外泌体作为高科技概念产品迅速风靡细胞治疗和药妆行业。当然,你听到的这些应用只是外泌体应用的冰山之一角。

今天我们就来聊一聊外泌体这个时髦的名词。

风靡市场的外泌体相关产品

其实,说起外泌体也是鼎鼎大名的,可以说也是诺奖级的。2013年的诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家詹姆斯·罗思曼、兰迪·谢克曼以及德国科学家托马斯·祖德霍夫,以表彰他们发现细胞的囊泡运输调控机制。外泌体就是囊泡的其中一种。

一句话概括就是:外泌体就是一部货拉拉,装了自家一堆乱七八糟的东西(里面有miRNA,mRNA和lncRNA,还有细胞因子,或许还有点DNA),然后分泌出细胞外,再接着进入另一个细胞,卸车完事。


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外泌体是何方神圣?

外泌体(exosome)是一类直径30-150nm,具有完整膜结构的细胞外囊泡,主要负责细胞间的物质运输和信息传递。

1983年,外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现, 1987年,Johnstone将其命名为"exosome"。起源于细胞内吞过程中形成的内体,最后再从细胞中释放到胞外。

作为细胞间的一种通讯方式,多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体,例如细胞培养液、血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体,经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中 。

外泌体的电镜照片

外泌体的电镜是鉴定外泌体形态大小的一个常规手段,电镜下呈典型的杯状形态。细胞外囊泡 (extracellular vesicles, EVs)是机体远距离细胞间交流的一种手段。目前主要被分为3大类:外泌体、微囊泡和凋亡小体,临床研究中主要关注的是外泌体。外泌体(直径30~150nm,富含RNA和蛋白质),再大的就属于微囊泡(直径100~350nm,富含金属蛋白酶和磷脂酰丝氨酸),再大就是凋亡小体(500~1000nm,富含组蛋白)了,由细胞凋亡产生。

外泌体、微泡、凋亡小体三姐妹



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外泌体的生物学效应和分离方法

外泌体发挥生物学效应的方式有哪里呢?主要有以下两种:

(1)直接作用。外泌体表面的蛋白分子或脂质配体直接激活靶细胞表面的受体,产生信号复合体并激活胞内信号通路;

(2)递送作用。外泌体可以与靶细胞的质膜融合或内吞直接进入细胞,将自身携带的蛋白质、核酸、脂质等活性分子带到细胞内,进而调控细胞的功能及生物学行为。

外泌体发挥生物学效应的方式(以MSCs为例)

超速离心法是分离外泌体的标准方法。在4℃条件下依次以300G,2000G,10000G的转速离心,依次去除细胞和细胞碎片等,再以100000G超速离心得到外泌体。但离心法每次处理的样本量较小,而且反复高速离心会导致外泌体破裂影响质量。可根据外泌体密度使用连续梯度蔗糖密度梯度离心法,蔗糖对细胞无毒,粘度不高且pH中性,所获外泌体纯度高,但含有难以去除的高密度化学物,不适合临床应用。超滤法用孔径小于100nm的超滤膜短时间低速离心就可以分离得到外泌体,但超滤时施加的压力比较大,导致体积大的囊泡变形和破裂。

超速离心法分离外泌体

我们也可通过CD63等外泌体特异性蛋白的抗体精准分离。另外,基于聚乙二醇(PEG6000)等聚合物沉淀的方法也被用于分离外泌体。也有研究人员将微流控技术和声学巧妙结合形成声流体装置,首先,利用较低频率(19.6 MHz)声波去除血液中尺寸较大的红细胞、白细胞以及血小板等;然后采用较高频率(39.4 MHz)的声波将外泌体与细胞外囊泡亚组成分(凋亡小体、较大的细胞外囊泡等)进行分离,并在通道的指定出口对外泌体进行收集。


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外泌体用于组织修复再生

由外泌体介导的递送具有以下几个优点:1、具有高度生物相容性,如果它们来自适当的细胞(例如间充质干细胞(MSCs)或未成熟的DC),则同时具备免疫惰性;2、能够穿越人体厚实的组织屏障,如血脑屏障(BBB)等。正常情况下,外泌体可以直接用作和免疫调节的潜在治疗剂。

虽然说,干细胞外泌体成为研究热点可能得益于干细胞研究的蓬勃发展,但干细胞外泌体确实有诸多优势。

  • 免疫原性低。外泌体比细胞具有更低的免疫原性。更容易地开发“货架”产品。

  • 易保存。外泌体在-20°C下储存6个月,-80°C长期保存,同时不会损失其生化活性。

  • 稳定。外泌体可保护其内容物免于降解,从而防止某些活性成分快速降解。

  • 可量产。外泌体可在培养基内大量富集。

  • 可控制。外泌体功能可通过改变细胞环境来改变。

MSCs外泌体具有免疫调节、抗炎和抗纤维化、抑制氧化应激、增强血管生成等作用。这主要依赖于其中的蛋白和核酸组分。例如MSCs外泌体富含糖酵解相关酶,可增加ATP的产生,减少组织细胞死亡。MSCs外泌体还含有VEGF、TGF-β1、IL-6、IL-10和HGF等细胞因子,有利于血管生成和免疫调节。2018年4月,FDA批准了Aegle公司的首个细胞外囊泡新药(IND)申请,以开始用于烧伤患者的临床试该公司通过分离纯化MSCs分泌的细胞外囊泡,用以治疗严重的皮肤病,包括烧伤和大疱性表皮松解症。

外泌体可以促进皮肤创面愈合:促进创面局部巨噬细胞从促炎M1向抑炎M2型转变从而有助于组织修复,抑制肌成纤维细胞分化和过度纤维化,从而减少瘢痕形成。有研究表明,人脂肪干细胞(ADSCs)来源的外泌体,含有丰富的miRNA-125A和miRNA-31,可显著促进血管生成。而人羊膜上皮细胞来源外泌体,通过刺激基质金属蛋白酶1(MMP1)的表达来调控细胞外基质沉积,从而促进创面愈合。MSCs外泌体,也可用于调控系统红斑狼疮所致的骨质疏松的BMSCs功能,增加骨密度促进骨再生。

外泌体中的miRNA,可以调控基因表达,其比例比细胞更高,例如miR-155、let-7f、miR-199a、miR-221、miR-125b-5p和miR-22等等,参与多种生理和病理过程。例如外泌体释放的miR-125b-5p就有助于改善心肌梗死区功能。


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外泌体用于肿瘤诊断和治疗

肿瘤细胞的外泌体,含有大量与肿瘤相关的核酸和蛋白,在癌症发生和早期检测中具有重要的研究和应用价值。例如通过使用49种抗体来检测来自431位肺癌患者和150位健康个体的外泌体蛋白发现,与健康个体相比,CD171和CD151在患者中高度表达,而外泌体CD151可作为检测小细胞肺癌的标志物

外泌体内容物作为肿瘤的潜在诊断标志物(数据来源:中华检验医学杂志)

寄生虫也可以,通过分泌外泌体将生物活性物质转移到宿主细胞中,调控宿主免疫,介导寄生虫的免疫逃逸。例如疟原虫、锥虫、血吸虫和弓形虫等均可以通过外泌体影响宿主免疫。

树突细胞外泌体,可激活肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞反应并抑制体内肿瘤生长,有关树突细胞外泌体应用的多种临床试验的开展,显示出其作为治疗方法应用的巨大潜力,但树突细胞外泌体表面PD-L1过表达限制其疗效,而基于树突细胞外泌体联合疗法如与PD-1/PD-L1中和抗体的联合应用,为树突细胞外泌体抗肿瘤治疗提供了新路径。


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如何看待外泌体的成药性

由于外泌体具有体积小、容易穿过细胞膜和免疫原性低等优点,可以作为药物的良好载体。外泌体结构较稳定,可以应对不良理化环境。

基于外泌体开发和应用的部分企业(图:干细胞者说制)

目前,许多基于外泌体的I/II期临床试验正在进行。不同来源的外泌体,在体内显示不同的归巢能力,这可能是与其膜表面受体和细胞外基质结合蛋白有关。静脉注射是基于外泌体递送药物中使用最为广泛的给药途径。腹腔注射、瘤内注射、口服和鼻腔给药也在多种疾病模型中得到了尝试。静脉注射外泌体24h后,肝脏中荧光信号最强,其次是脾脏、胃肠道和肺部。

因此,外泌体注射后的分布,以及长期的影响和安全性,仍将需要进一步探索和阐明。

外泌体载药可以分为三种:外源性载药、内源性载药和转基因。

  • 外源性载药方式先分离外泌体,再将药物通过转染或电穿孔导入外泌体;

  • 内源性载药方式:先将药物导入细胞中,当药物进入外泌体且从供体细胞中释放后,分离纯化得到载药外泌体;

  • 转基因方式:通过转基因的方式让细胞自身表达,最终随外泌体分泌至细胞外。

外泌体规模化应用开发关键在于两点:一是依赖于细胞培养条件的提升,3D培养是一个方向。二是依赖于外泌体分离纯化方法的提升,滤膜分离是一个方向。哺乳动物细胞释放的外泌体较少,产量不高,可依次通过10μm、5μm和1μm的聚碳酸酯膜挤出外泌体-模拟纳米囊泡,通过富集,产量比天然外泌体高出100倍以上,产量高且易于纯化,为外泌体规模化应用于临床提供了可能。

近几年,关于外泌体的研究文章数量呈井喷式发展,无论是提取制备工艺还是作为一种治疗制剂和药物,或者作为疾病的新型诊断标志物,都有了长足的发展。外泌体有希望成为人们通向健康大门的桥梁。

参考文献(部分)

1.Exosomes: composition, biogenesis and function." Nat Rev Immunol 2(8): 569-579.2002

2.Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol 200(4): 373-383.2013

3.Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities." Nat Rev Drug Discov 12(5): 347-357.2013

4.Human umbilical cord mesenchymal stem cells and exosomes: bioactive ways of tissue injury repair[J].Am J Transl Res. 11(3): 1230–1240.2019; 


作者简介:

泡泡先生,国内知名三甲医院副教授,兴趣广泛,爱好众多。关注细胞治疗、外泌体、3D打印,生物材料等和细胞相关的一切。



如何看待“脂肪干细胞在临床医学的应用”?

泡泡科普:

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如何看待“脂肪干细胞在临床医学的应用”?

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