开启角膜患者光明之窗的干细胞产品：HOLOCLAR
从点击上方蓝色小字↑↑↑------“干细胞者说”，加星标，长期订阅本科普号。
不贬不褒
如实陈述
方为科普之道
干细胞药物开发无疑是细胞治疗未来的发展方向。作为从业者，下一步该怎么走？我们不妨可以看看欧洲的第一款干细胞药物：Holoclar。通过了解它，或许我们能得到启发-----他山之石，可以攻玉。
撰文：全能小细胞
来源：干细胞者说
眼睛是心灵的窗户，而角膜则可以称得上是眼睛的窗户。角膜之所以维持透明，它表面的上皮细胞功不可没。我们人类的角膜上皮细胞不断生长，不断更新，而维持这种更新的源泉就是角膜缘干细胞。当角膜缘干细胞缺乏时（即角膜缘干细胞缺乏症，limbal stem cell deficiency，LSCD），会导致角膜上皮持续性缺损，角膜血管化、角膜溃疡感染、不透明，严重者造成角膜穿孔、甚至危及整个眼球，导致失明。
干细胞是一类具有自我更新和多向分化能力的细胞，它是各种组织细胞的种子细胞，能够修复替代受损的组织和器官，为组织器官的再生带来新的希望。因此，干细胞很有可能开启角膜患者的光明之窗。
1
角膜缘干细胞治疗全球概况
以“Limbal Stem-cell Deficiency（角膜缘干细胞缺乏症）+Stem Cell（干细胞）”为关键词进行搜索，在美国临床试验网站上登记的治疗角膜缘干细胞缺乏症临床试验共计28项。（截至2019年7月21日）
开展临床试验应用的干细胞有两种，分别是角膜缘干细胞和自体口腔粘膜干细胞。本文主要针对角膜缘干细胞在角膜疾病治疗方面的临床探索进行介绍。
2
第一款眼科干细胞药物：HOLOCLAR
第一个我们介绍的是，经培养后的角膜缘上皮干细胞（Cultivated limbalepithelial transplantation (CLET)）移植治疗角膜缘干细胞缺乏症。典型的产品就是欧盟第一个干细胞药物：HOLOCLAR。
干细胞获取方法：通过分离供体角膜缘组织或自体健康眼1mm2 大小的角膜缘组织，体外酶消化处理，经过10天左右的培养时间，获得足够量的角膜缘干细胞，经过细胞鉴定和安全性检测，验证合格的干细胞可进一步用于临床治疗研究。
干细胞移植方法：角膜本身存在生理曲度，单纯的细胞悬液移植无法使干细胞定植到损伤区域，因此临床上角膜缘干细胞通常与支架材料联合移植。
欧盟批准的第一个干细胞药物——HOLOCLAR，就是将角膜缘上皮干细胞种植于纤维蛋白胶支架上的一种组织工程干细胞产品。Holoclar在2008年11月7日被指定为“孤儿药”(一种用于罕见疾病的药物)，并且于2015年2月17日获得批准，在欧盟上市。
这个产品成功有两个关键因素。第一个毫无疑问，自然是角膜缘上皮干细胞。第二个，纤维蛋白胶（Fibrin Glue，FG）支架也功不可没。
当纤维蛋白原遇到凝血酶原时，会发生凝集反应，形成纤维蛋白固化物（即生物胶水）。通过调整纤维蛋白原和凝血酶原的比例，使其匀速凝集形成透明的，有弹性的生物膜支架材料，可用于移植。
当细胞种植于纤维蛋白胶，形成铺路石样上皮细胞样结构后，便可开始进行移植。随着移植细胞的生长延伸，与角膜微环境的相互作用，纤维蛋白胶会不断降解，只留下干细胞，完成后续的修复治疗。
第一个眼科干细胞药物：HOLOCLAR
2010年，由意大利摩德纳大学再生医学中心的P.Rama 和G. Pellegrini两位教授开展了一项纳入112例角膜缘干细胞缺乏症患者的临床试验研究，该研究应用HOLOCLAR治疗各种原因造成的角膜缘干细胞缺乏症患者，其中有11个患者的眼接受二次HOLOCLAR治疗。临床效果的评价由两名医生独立进行受试者的术后检查和随访，收集数据、评估治疗效果。
临床有效性评价标准：
主要移植成功标准：移植治疗一年后，所有受试眼不再出现角膜上皮持续性缺损、角膜云翳和角膜感染等症状。
次要移植成功标准：角膜上皮缺损和角膜感染症状消失，而角膜浅层再发生血管化，其程度较入组时显著减轻；
治疗失败标准：角膜上皮仍持续缺损、角膜云翳和角膜感染再发生，认为移植失败。
常见副作用：眼睑炎症(1/10的概率)
研究至少达1年，随访最长达10年（随访平均年限是: 2.91±1.99：中位值: 1.93年）。临床结果证明，主要成功率为：76.6%，次要成功率：13.1%，失败率：10.3%。
两位教授研究发现，体外培养的角膜缘干细胞移植成功的关键因素取决于角膜缘干细胞全克隆中P63蛋白的表达，P63蛋白是角膜缘干细胞特异性标志蛋白。当P63的表达量大于3%时，78.1%的受试者角膜上皮重建，无新生血管，移植成功；而当P63表达量小于3%时，66.7%受试眼移植失败。
据目前美国临床试验网站上登记，正在进行的HOLOCLAR临床试验有2项：
第一项临床试验，是一个接近完成Phase 4 临床试验项目。目的是评价70名受试者在接受一次或两次HOLOCLAR治疗后，随访1年以上，评估其安全性和有效性评价。该研究正处于招募患者阶段。
第二项临床试验，是一个回顾性分析试验项目。目的是评估接受HOLOCLAR治疗后长期观察的安全性和有效性，同时进一步统计分析HOLOCLAR治疗与角膜移植手术成功率的相关性。该项目也正在招募受试者。
3
技术备胎：SLET技术
第二个我们介绍的是，角膜缘上皮组织移植（Simple limbal epithelial transplantation (SLET)）治疗单侧角膜缘干细胞缺乏症。
SLET技术，是2012年印度科学家Sangwan发明的，该技术的研制初衷是：为了降低产品的研发成本，满足于无法开展CLET技术的基础眼科医疗单位。可以说是CLET干细胞治疗技术（HOLOCLAR）的备胎。
2016年，SangWan报道了125例受试者，应用SLET治疗的临床研究结果。经过平均1.5年随访，76%的受试者角膜完全再上皮化、无新生血管，角膜透明；另一项回顾性临床试验，纳入68只角膜缘干细胞缺乏症眼，经过SLET治疗后六个月，其成功率是83.8%，其中64.7%受试者视力提高至少两行。
在SLET的临床研究中发现，羊膜是移植成功的重要因素，羊膜提供了干细胞生长所需的营养因子和微环境，研究还发现冻干的羊膜同样适用。自体角膜缘干细胞或组织就像“种子”，而其所处的微环境就像提供“种子”营养的“土壤”，在这里羊膜充当了这一角色，而纤维蛋白胶起到了固定细胞或组织作用。若单纯的进行角膜移植，则可能因为缺乏健康的“土壤”和持续繁衍更新的“种子”，最终会发生排斥反应或角膜上皮持续不愈合而导致手术失败。
在美国临床试验网站上登记的SLET的临床试验研究：ClinicalTrials.gov Identifier: NCT04021875，由国立台湾大学附属医院眼科Wei-Li Chen教授负责，研究计划招募30名受试者，评估SLET临床应用的安全性和有效性。
4
其他角膜移植项目情况
自体角膜缘干细胞移植，是治疗单侧角膜缘干细胞缺乏症的一种有效方法。尽管，SLET方法操作相对简单，制备成本低廉，也无需特殊医疗设备和医技人员，易于临床推广应用。但是美中不足的是，它仅适用于单侧轻度角膜缘干细胞缺乏症患者；而CLET方法适用于中、重度角膜缘缺乏症患者，同时该技术和结合基因编辑技术，对遗传性角膜疾病也可以进行纠正治疗。
除了上述两项技术，还有各种很多治疗角膜干细胞缺乏症的报道。
2018年5月，英国纽卡斯尔大学（Newcastle University）教授车康恩教授团队以供体干细胞、藻酸盐和胶原蛋白为原料，首次采用3D打印技术打印出人眼角膜。尚未进入人体临床研究阶段。
2018年，厦门大学李炜教授团队于国内首次开展基于羊膜载体组织工程角膜上皮的临床实验，并应用于严重角膜缘干细胞缺乏症患者的治疗。该研究采用羊膜载体扩增培养角膜缘干细胞，长成上皮植片，然后将植片连同羊膜载体一起移植进入患者眼球表面。目前，已实施了30多例移植手术，获得了良好的治疗效果。
2019年，日本有条件批准了全球首个人诱导多能干细胞（iPS细胞）角膜移植的临床试验计划。日本大阪大学的眼科医师西田幸二负责，预计治疗4名患者，并进行为期一年的观察，以确定该疗法的安全性和有效性。
参考文献：
【1】Paolo Rama, et al(2010): Limbal Stem Cell Therapy and Long-Term Corneal Regeneration. The new England journal of medicine 363:147-155.
【2】Virender S Sangwan, et al(2012): Simplelimbal epithelial transplantation (SLET): a novel surgical technique for thetreatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Br J Ophthalmol 2012；96:931-934.
【3】Borroni D & Parekh M et al(2018)：Simple Limbal Epithelial Transplantation (SLET): A review on current approachand future directions. Survey of Ophthalmology.
【4】https://www.ema.europa.eu/en/medicines/human/EPAR/holoclar
【5】https://japan.cnet.com/release/30303978/
【6】https://resou.osaka-u.ac.jp/ja/research/2019/20190306_1
【7】Scientists 3D print human cornea for first time, a technique which could save millions from blindness
作者简介：
全能小细胞，一位致力于眼科干细胞临床转化研究的光明女神，美貌与智慧并存。趣味科普
— END —
干细胞者说
- 科普 情怀 责任 -