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临床级间充质干细胞的技术壁垒:工艺制造

步步先生 干细胞者说 2022-07-07

间充质干细胞的扫描电镜图    Steve Gschmeissner/SPL

“你之所以活着,是因为你不断地更新各种组织和器官,或让它们恢复活力。在体内,皮肤、肠道和血液等细胞逐渐成熟,在一段时间内发挥功能,然后过期,被不断更新的细胞取代,从而更新组织。在每一个发生这种年轻化过程的组织中,都存在一个产生这些分化细胞的来源。这个来源被称为 ‘干细胞’。”

美国生物学家 Arnold Caplan 在他的主页上这样写道



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书接上回,在上一期<临床级间充质干细胞的技术壁垒:国际纵览>里,我们简述了以Alofisel、Temcell和Stempeucel为代表的商业化间充质干细胞疗法,同时也概述了我国干细胞临床研究和转化现状,最后指出了间充质干细胞药物开发面临的技术壁垒。

如果要开发一种“现货型”同种异基因间充质干细胞产品,异质性必然是是一道迈不过去的坎。如何去面对这个挑战,如何将间充质干细胞产品异质性的影响降到最低。


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间充质干细胞的基本概念

2006年,国际细胞治疗协会(ISCT给出了间充质干细胞定义的最基本定义,也就是间充质干细胞最低的鉴定标准:从细胞形态,表面标记和分化能力三个方面定义了人类间充质干细胞(hMSCs)的最基本标准。
  • MSCs在标准培养条件下,呈贴壁生长;

  • MSCs表达CD105、CD73和CD90,不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19及HLA-DR表面标记;

  • MSCs在体外诱导可以分化为成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞

然而,人类间充质干细胞最基本标准这只是反映了“干性”,而不是决定其治疗属性的免疫调节和血管再生作用。况且,不同来源的MSCs表面分子特征差异巨大研究结果提示,不同组织来源的MSCs具有差异性(比如细胞大小、增殖潜能、分泌细胞因子种类和数量,免疫抑制能力也不尽相同)。

2019年,ISCT继续完善了MSCs的基本标准,增加了两点:第一,MSCs的组织来源。第二,与治疗疾病相关的MSCs功能测定


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间充质干细胞产品的异质性

间充质干细胞疗法在某些疾病上取得了巨大成功,这的确让业内专家兴奋不已。纵观先前的大量临床试验,间充质干细胞疗法还存在一定的临床局限性。临床失败的关键在于,其免疫调节血管再生作用在临床试验中具有不可预测性。究其本质,根源在于MSCs是一种活的药物,其关键质量属性(CQAs)很难界定。

间充质干细胞产品的CQAs


MSCs产品的常规检测,除了鉴定、活性、纯度、效力、增殖能力、基因组稳定性和微生物实验等评估外,还应检测与MSCs治疗功能相关的关键质量属性(比如抑制T细胞增殖或IDO表达)

图1. 间充质干细胞的质控体系总览(步步先生绘制)

如何评价细胞产品的CQAs,这是细胞治疗领域面临的独特的一个挑战。传统的化学药品,其结构和效力是可以严格定义。而MSCs产品则不同,这是一种动态“活的药物”。


临床试验开始前,MSCs标准化产品的治疗效力是至关重要的。效力(Potency),FDA给出的定义是 “在适当实验室方法检测下或在预期方式管理条件下,通过大量临床数据获得产品的特殊能力或功能。” 通常,效力用来评价药物产生特定生理功能的浓度或数量,由强度(strength)和效果(effectiveness)两个因素组成,即相同强度(一般指浓度)下所取得的效果。


正是因为如此,开发一种针对MSCs产品效力的测定方法非常有必要,准确地将MSCs产品的CQA与它们的治疗功能相关联。目前,用于间充质干细胞产品效力最广泛的评价方法是:淋巴细胞增殖抑制试验与免疫调节功能的替代标志物(即IDO表达或TSG-6表达)相比,显然不如后者被认为更能代表效力,因为它可以直接读出生物活性。


间充质干细胞产品的异质性


MSCs是一种异质性细胞群,其基因和蛋白表达谱图与很多因素有关(诸如供体特征,组织来源,分离方法,以及体外扩增培养方式)。不同供体、不同组织来源,甚至不同的制备工艺都可能会造成MSCs终产品出现异质性。


下面是MSCs异质性造成不同治疗效果:
  • 针对GVHD适应症,Mesoblast 公司开展的3期临床试验(NCT00366145)中,Remestemcel-L是来自1个供体扩增至3-4代的MSCs,以满足240名受试者的使用需求。临床试验结果比较积极,但未能达到主要临床终点。
  • 同样是针对GVHD适应,法兰克福大学医院开展的2期临床试验中,使用了来自8个供体混合的1-2代 MSCs,治疗26名患者,取得了77%的总缓解率。
为什么会出现不同的临床结果?这是MSCs产品的异质性(供体不同,细胞代次不同,工艺不同)的原因,还是患者疾病个体化差异造成的的原因?需要肯定的是:如果干细胞采用自动化制备,既可减少制备过程中的人为操作因素,也能降低产品异质性风险。

目前,在制备过程中尽量避免MSCs产品异质性的策略有两种:

  生物材料 

第一种是使用生物材料。在聚乙二醇水凝胶基质上,MSCs的扩增过程可避免细胞表面标志物和细胞因子表达的降低。3D培养系统也有利于MSCs在扩增过程中维持早期传代的表型。

  诱导多能干细胞

第二种是使用多能干细胞。由于iPSC增殖能力更强,因此可以轻松扩增大量iPSC,然后再分化获得大量的MSCs。因此,iPSC-MSCs可能是规模化生产MSCs的有效解决方案。

  低温保存和复壮培养

MSCs产品异质性的另一大挑战,是冷冻保存对MSCs效力存在潜在的不利影响。研究发现,可以通“培养复壮”MSCs的方式来解决。

例如,Alofisel治疗肛周瘘管3期临床试验的成功,可能就归功于对解冻后的MSCs采用了“培养复苏”的策略,即在使用解冻的MSCs前进行短暂复苏培养,从解冻到输注需要至少24小时。这个研究成功表明,冷冻对细胞的不利影响是可逆的。


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如何增强间充质干细胞的治疗效果

如果建立MSCs产品效力的标准化质控方案,则有助于降低临床失败的风险。虽然不能完全避免临床失败,毕竟MSCs本身也不可治疗所有疾病,它不是包治百病的“万能神药”。临床试验表明,在保证安全性的前提下,MSCs的大剂量输注可保证某些临床应用的有效性


为了最大限度地发挥临床效力,促进MSCs的“天然属性”,且独立于冷冻保存,扩增倍数,供体和组织来源等,我们可通过生物工程解决方案,可增强MSCs的“天然属性”。

图2. 如何增强间充质干细胞的“天然属性”

A)小分子“预处理”,可促进MSCs免疫调节和再生因子分泌。优点是简单有效,缺点是作用短,仅持续数小时至数天。

B)颗粒化处理,可维持MSCs免疫抑制很长时间,优点是不挑细胞,缺点是成本贵。

C)基因修饰出来,可通过基因修饰MSCs过表达某些因子,要么增强其固有功能,要么过表达其他治疗方法,要么改造成可用于癌症治疗的细胞。

D)溶瘤病毒处理,MSCs可屏蔽溶瘤病毒以躲避自身免疫细胞攻击,并在肿瘤组织中释放病毒以杀死肿瘤细胞。


小分子预处理


小分子“预处理”,是一种增强MSCs治疗效果的简单策略。其中最著名的就是Brainstorm公司的MSCs产品NurOwn®,其专利培养基(含GDNF、HGF和VEGF等)可诱导细胞分泌高水平神经营养因子(NTF),将MSCs转化为MSC-NTF细胞,后者可以直接递送至损伤部位,分泌多种神经营养因子和免疫调控因子,触发生物学效应,最终减缓或稳定疾病进展。

在II期临床试验(NCT02017912)中,渐冻人症患者在接受NurOwn®治疗24个月后,病情进展与对照组相比减缓。Brainstorm正在扩大NurOwn®的适应症范围,招募患者参加硬皮病(NCT03799718)的II期临床试验。

载药颗粒处理


小分子“预处理”虽然有用,但效果仅持续数小时到几天。因此,一种小分子封装微粒(MPs)也被用于提高MSCs产品的效力。MP含有生物相容性材料,可以根据其成分、分子量、载药量和药物释放速度,来调控MSCs产品的治疗作用。说白了,就是一种缓释剂。


与经游离的布地奈德(一种肾上腺皮质激素类药)“预处理”的MSCs相比,载有布地奈德的MP处理MSCs后,在体外显示出四倍的IDO活性增强。实验结果是:经IFN-γ刺激后,间充质干细胞产品对外周血单个核细胞(PBMC)的抑制作用提高了两倍


基因改造


除了增强其“天然属性”,另一种策略是对MSCs进行基因改造,将其改造成生物制剂“生产车间”。为了在MSCs内产生所需的生物制剂,转导和转染是最常见的方法。

Suresh等人的一项研究表明,经过基因工程改造的MSCs,通过表达一种具有抗氧化作用的蛋白,在大鼠模型中改善了心肌梗死后的心脏功能。此外,还可以将MSCs改造成携带抗肿瘤药物的载体。MSCs可以避免免疫细胞追杀,利用肿瘤趋化性到达肿瘤部位,达到癌症治疗的目的。

溶瘤病毒处理


溶瘤病毒(OVs)处理也是一个策略,可直接裂解肿瘤细胞,或触发抗肿瘤免疫反应,通过MSCs作为其载体,定位到肿瘤部位,释放溶瘤病毒发挥作用。如果在MSCs中装载OVs,则可有效保护OVs免受机体破坏而影响其有效性,有点类似于“特洛伊木马”。使用MSCs作为OVs载体的一个限制是:MSCs在转导时仅表现出中等感染力


基于溶瘤病毒技术联合MSCs疗法临床试验(NCT02068794),用于治疗复发性卵巢癌。临床前数据显示,用OV-MSCs治疗SKOV3卵巢癌小鼠后,小鼠寿命明显长于仅用OVs治疗的小鼠。



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文末小结

本期内容,我们简单介绍了MSCs的最基本标准,新增两条标准:细胞的组织来源效力评价。在开始临床试验之前,MSCs产品效力的标准化是至关重要的。

然而,不同供体、不同组织来源,甚至不同的工艺制造都可能造成MSCs的异质性,这给临床结果稳定性制造了不小的挑战。我们可通过生物工程解决方案(小分子预处理,载药颗粒处理、基因改造和溶瘤病毒处理),可增强MSCs的治疗效果。

如果建立MSCs产品效力的标准化质控方案,则会降低其异质性的影响,有助于降低临床治疗失败的风险。当然,不同给药途径和患者适应症的选择也是影响MSCs临床成功的关键因素。

下一期,我们将针对间充质干细胞的给药方式展开论述,敬请期待!

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