高效液相色谱流动相中气泡的产生以及脱气方式

1. 概述

众所周知，液相色谱分析所用的流动相在使用之前，需要进行脱气处理。由于空气的主要成分是氮气、氧气以及少量的二氧化碳，而氮气类似于氦气，在常用到的流动相洗脱溶剂中的溶解度较小，因此我们所说的脱气处理也亦可以理解为脱除氧气处理。流动相中的空气/氧气溶解能力与流动相组成、所处的压力以及温度有关，因此，当所用的流动相未经脱气处理时候，在HPLC系统中的混合节点、压力变化节点以及温度变化节点，均有可能由于过饱和而形成气泡，最终干扰到检测结果。

流动相未经脱气处理，在HPLC运行时，可能导致多种不利情况发生，如下图1所示。

如上图1所示，管路以及泵内存在气泡的话，可能使得色谱峰保留时间以及峰面积发生变化，给化合物的定性以及定量检测带来影响；色谱柱内进入气泡或者气泡在色谱柱内的边角处驻留，一般会导致色谱峰变异(前沿或者拖尾)；流通池内进入气泡或者溶解空气量发生变化的话，一般会导致尖刺峰或锯齿状峰，并伴随有拖尾或前沿，信号强度衰减以及基线噪音水平变高。

此外流动相脱气程度还会影响HPLC系统峰的形状以及大小，这一点还与在分析过程中使用的配样溶剂或稀释剂是否经过脱气处理以及脱气的程度有关，如下图2所示。

图2A所示结果为使用经脱气处理后的流动相，图2B所示结果为使用未经脱气处理的流动相，二者均进样流动相组成的溶剂，区别在于a为经空气饱和，b为用氦气脱气处理，c为用氧气purge。从图中我们可以看到二者的系统峰存在差异。

最后，流动相或者样品配置溶剂未经过脱气处理(这里主要是指脱除氧气)，一些不耐受氧化的样品可能会被氧化而影响最终的分析结果(如相关物质检查、纯度检测以及Stress degradation中的氧化条件下的降解实验等)。

2. 气泡是怎么产生的

如前所述气体在溶剂中的溶解度不仅与溶剂的种类有关，也与所处的温度以及气体分压有关，如下图3所示。不同气体在同种溶剂中的溶解度随温度的升高而减小，随着分压的增加而增加。其中氦气随温度的变化比较小，这也是通常使用氦气作为脱气介质的原因之一。

其中图3B也部分程度上解释了为什么在二元高压混合体系下HPLC系统中，溶剂在混合之后出现气泡的概率要比四元低压混合体系出现气泡的概率低。

不同气体在不同的溶剂中的溶解度不同，反相液相色谱方法中常用的溶剂有水、乙腈、甲醇、四氢呋喃以及正相液相色谱方法中常用到的正己烷、乙醇、异丙醇等。以氧气为例，在反相液相色谱中最常用的3种有机溶剂中的溶解度为甲醇>四氢呋喃>乙腈。如下图4A所示，空气(主要是氮气以及氧气)在几种溶剂中的饱和溶解度，其中在水中的溶解度要明显小于在有机溶剂中的溶解度，一般地，空气的溶解度随溶剂的极性增加而减小。此外，空气在缓冲盐中的溶解度要小于纯水中的溶解度。

如图4B所示，A点为氧气在纯水中的饱和溶解度，B点为氧气在纯乙醇中的溶解度。当将经氧气饱和的纯水以及乙醇按照1：1混合时，氧气在混合溶剂中的饱和溶解度在D点，而实际溶解的氧气量则在C点。此时的状态(C点)则可称为过饱和状态，氧气在该状态下会自发形成气泡或者仪器的连接死体积处或管路的某一粗糙接触面处以及压力和温度变换区，形成气泡从混合溶剂中溢出。

如低压混合模式下，不同的空气饱和溶剂经混合器混合之后，形成过饱和混合溶剂，由于混合区处于低压状态，有可能形成气泡。而在高压混合模式下，这种概率就较小，由于混合区处于高压状态，空气的溶解度增加，溶剂在混合之后可能仍然处于非过饱和状态。

此外，即使溶剂中溶解的空气(氧气)不会因为过饱和而形成气泡从混合溶剂中溢出，仍然会对分析造成影响，如下图5所示。

如图5A所示，溶剂在脱气处理前后的紫外吸收对比，很显然，溶剂中溶解的空气越多(溶剂种类不变)，其紫外吸收越大。一般地，空气对于几种溶剂的紫外吸收贡献大小为THF>MeOH>Hexane>ACN>Water，如图5B所示。溶解在溶剂内的空气会导致基线背景变高，对色谱的基线以及分析方法的检出能力以及定量范围造成不利影响。一般地，新开瓶的有机溶剂中的空气含量较少，而开瓶之后的溶剂由于长时间处于空气里，最终会形成饱和溶剂。因此在使用非新开瓶溶剂时，一定要进行脱气处理(空气在有机溶剂中的饱和溶解度明显大于水中饱和溶解度)。

3. 流路中气泡引起的色谱问题

HPLC流路中多处都可能会形成气泡，如在泵前产生气泡多为流动相在配置过程中产生的或者过饱和溶剂在接触到泵的吸滤头时产生。如实验室环境的温度控制较差，温度升高，导致溶剂溶解空气的能力降低，又如在使用混合溶剂的时候，由于不同的溶剂在混合时吸热，导致混合溶剂的温度较低，而在使用的过程中，温度逐渐与室温一致，空气的溶解度变小。

形成的气泡经泵的吸滤头以及管线进入泵的泵头(如图6B所示)，由于在吸入液体的过程中，泵腔内的压力较低，气泡在低压区扩展导致实际泵入泵腔内的流动相减少；在流动相被从腔内推出的过程中(如图6A)，气泡在高压区而被压缩，实际泵出的液体量小于正常值，此时伴随有柱前压失压现象(如图6C)，最终使得化合物的色谱峰保留时间增加，峰面积发生很大改变，影响色谱定性与定量的结果(如图6D所示)。

此外，吸滤头如果发生堵塞的话，亦会造成压力降的产生，进而产生气泡，其结果类似于上述情况。此时需要对吸滤头进行清洗(如超声以及使用不同极性的溶剂依次冲洗)，如冲洗之后在较大流速(如8mL/min)条件下，依然有气泡产生则需要更换吸滤头。

4. 色谱柱中气泡引起的色谱问题

一般地，在色谱柱的入口端极少会产生气泡，而在色谱柱出口段则易于产生气泡(色谱柱入口端压力大，出口端压力小)。当在色谱柱的出口端有气泡产生时(如下图7A所示)，流动相在遇到气泡时，其流动方向发生改变形成扰流现象，进而导致色谱峰前沿或者拖尾(如图7B所示)。此外，色谱柱内经越大，气泡越不易于冲出，而对色谱峰产生持续干扰，此时可将出口端朝下，更换甲醇较大流速将气泡冲出。

此外，流通池内产生的气泡或者流动相未经脱气处理对检测产生的影响，在前期文章中也有详细介绍，这里从略。

5. 脱气方法

脱气方法可分为在线脱气与离线脱气，其中离线脱气有加热脱气法，超声脱气法，抽真空(加热)脱气法，加热回流脱气法。在线脱气法则是配置在线脱气机进行脱气，如图8A所示。在线脱气机的脱气效果与HPLC系统的流速有关，一般流速越大，其在线脱气的效果越差，如图8B所示。

在线脱气机的工作模式有：真空泵时刻工作，固定rpm；真空泵根据压力状态，按需工作以及真空泵按照固定时间间隔进行开/关模式切换。一般使用的是第二种工作方式的在线脱气机，当色谱基线出现Cycle型的波动时，有时是由于脱气机故障引起的。

此外，为减少气泡进入流路中，一般将流动相瓶置于较高处。

6. 结论

流动相中过多的空气不仅会增大色谱基线背景噪音，在过饱和状态下形成气泡从流动相中溢出，将导致各种各样的色谱问题，如色谱峰保留时间与积分面积发生变化，色谱峰峰形变异(如拖尾或前沿)以及鬼峰等，对分析方法的定性与定量能力产生不利影响。对HPLC系统配备在线脱气机，对流动相进行脱气处理，可最大程度地避免由于脱气不充分引起的色谱问题。

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作者信息

Bruce Lee

作者微信号：Lindaring001

作者公众号：Pharma_Analytical

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