守护健康，抵抗耐受——帕纳替尼的研发之旅

刘sir专栏作者
药物研发领域小白，对药物研发曲折历程有浓厚兴趣，愿与诸君共同学习。

摘要

伊马替尼的上市开创了靶向药物分子治疗的新领域，但是“道高一尺，魔高一丈”，伊马替尼的反复服用，容易刺激Bcr-Abl激酶发生变异，这也是白血病细胞产生伊马替尼抗性的主要原因，尽管格列卫（伊马替尼）耐药期相对较长，但是，只要患者服用，总有一天会耐药的。

那么，对于治疗耐受伊马替尼的慢性粒细胞白血病（CML）患者怎么办呢？帕纳替尼（ponatinib）将是最好的选择！

帕纳替尼虽然上市晚于伊马替尼10年，却是针对伊马替尼耐药的患者，其研发过程做到了精雕细刻的考察、反复地验证，整个过程是严谨的、是艰辛的，研发的源头性和路径上也具有独立和独创的品格。

01

源于骨质疏松药物的研究

帕纳替尼开始的研究并没有借鉴和模拟伊马替尼的思路，而是源于研究骨质疏松药物。实验证明，Src过表达可引起骨质疏松，Src基因敲除小鼠可避免骨质疏松的发生。基于此，ARIAD公司以Src激酶为靶标研制抗骨质疏松药物。选择嘧啶并吡咯和嘧啶并吡唑类化合物作为筛选苗头，源于诺华和辉瑞公司曾报道过这类化合物具有活性。ARIAD发现化合物1抑制Src激酶IC₅₀值40 nmol·L^-1, 进而变换结构，化合物2和3的IC₅₀值分别为4 nmol·L^-1和20 nmol·L^-1。

在研究上述内容的同时，ARIAD还启动了以依赖周期蛋白激酶(CDK)为靶标，研发抗骨质疏松的课题。2,6,9-三取代嘌呤化合物purvalanol A(4)是CDK强效抑制剂。化合物4抑制CDK2的活性IC₅₀高达70nmol·L^-1，但抑制与骨质疏松相关的Src激酶活性不高，IC₅₀=0.24μmol·L^-1，由此设计合成了在嘌呤2,6,9-位变换不同取代的化合物。

将化合物4中2位的异丙基去除后，活性降低6倍；再将9位的异丙基换成间羟基苯乙基，活性提高60倍，这提示9位为大片段有利于同靶标的结合。6位的氯苯基去除氯原子后活性几乎不变，但是2位烷胺基换成环戊基时活性略有下降，而6位的苯环对位连接氧化膦基或亚甲二膦酸基时，对Src激酶抑制活性显著提高，其中化合物9活性最高，IC₅₀=0.45nmol·L^-1，代号为AP23464，为里程碑式化合物。


02

转向研究CML的双重抑制剂

持续服用伊马替尼引起的耐药性是由于激酶的突变，除了Abl变异之外，Src 酪氨酸激酶家族的Lyn、Hck和Lyn等也发生突变， ARIAD进而以耐药的CML为目标，研究对Src/Abl双靶标抑制的药物。
化合物9对两个激酶Src/Abl的抑制作用IC₅₀都低于1 nmol·L^-1， 根据化合物9与Src晶体结构信息，认为将亚乙基的柔性连接基刚性化，以固定末端苯环的取向，应能提高活性。用分子对接方法将N9连接的乙苯基变换成trans-乙烯苯10，由于双键的定向作用，使苯基结合于激酶突变后产生的特异性疏水腔。同时也合成了cis-乙烯苯11以验证对接结果。进而模仿达沙替尼的结构片段，合成了trans-乙烯2,6-二甲苯基化合物12和cis-乙烯2,6二甲苯基13，抑制酶和细胞的活性进一步提高。然而，化合物10和12对Src和Abl抑制活性相差较大, 为提高对Abl激酶的活性，将二丙膦氧基片段换为体积较小的二甲基化合物14，拉近了对Src和Abl的活性，为此固定二甲基膦氧基不变，变换N9乙烯基连接的芳环。

03

另一路径—设计DFG-out构象的抑制剂

上述以化合物9为先导物所优化的双重抑制剂，N9连接的片段所结合的位点是活化环套的DFG呈与ATP结合的状态，即结合于DFG-in构象的抑制剂。同时进行的另一途径是合成激酶的活化环套呈DFG-out构象的抑制剂，犹如伊马替尼结合样式。Abl激酶与抑制剂的晶体结构表明，当活化环套呈DFG-out构象时，抑制剂N9连接的二芳酰胺片段与酶形成了氢键网络，故而设计了化合物15。
3.1 C6取代基的变换

活性评价结果证实，化合物15对Src和Abl都有较高活性，而且在10 μmol·L^-1浓度下对正常细胞无作用，提示有高选择性。大鼠药代动力学实验表明15的口服利用度F=20%，半衰期很短，是由于C6的甲胺基发生氧化去甲基作用。故而合成了环丙基化合物16(环丙基代谢稳定性高于甲基)，仍保持了酶和细胞活性，而改善了药代，F=40%，血浆中有高暴露量。环丙基的亲脂性强于甲基，推论进一步增高亲脂性会有利于活性。为此合成了芳环17～22，吡啶和嘧啶化合物活性都很高，但2-吡啶基化合物17却很低，可能是由于2'-N与嘌呤N1的电性排斥作用，芳环扭转，破坏了共面性，而18和19没有排斥作用(但嘧啶也有邻位排斥作用，活性下降却不明显)。化合物21移植了9的模块，Scr和Abl活性都比较高。22的活性很弱。然而这些高活性化合物的大鼠药代都不好，因而将C6-环丙胺基固定做进一步优化。

3.2 N9连接片段的变换——借鉴尼洛替尼的设计优化N9位置，借鉴了诺华的尼洛替尼的设计理念，合成了脲基和反向酰胺连接的化合物23和24。23几乎没有活性，而24的-CONH-比区域异构体16的-NHCO-活性强，犹如尼洛替尼活性强于伊马替尼。为此，以24为新起点，优化末端芳环。构效关系表明，在三氟甲苯基环上再加入卤素(25、26)活性减弱，三氟甲基换成叔丁基(27)，对Src活性提高一倍多，但抑制Abl作用降低，提示这两种激酶结合腔的差异。化合物28为异丙基，都比叔丁基弱。然而27亲脂性过强，clogP=6.76，超过化合物24，综合考虑27不可取。含叔丁基的芳杂环化合物中异噁唑29对Scr和Abl都很强，但大鼠药代不如24。化合物30的活性优于24，而且亲脂性比24降低10倍。有趣的是，将上市药物尼洛替尼的“大块片段”连接在酰胺上，化合物31活性非常高，说明该优化的模块适用于本系列中，也意味着与激酶结合的相似性。

3.3 连接基乙烯基的变换

持续应用伊马替尼可引起Abl激酶发生变异(Abl^T315I)，即门户残基Thr315 突变Ile315，T315I突变的后果。氨基酸侧链由CH(CH₃)OH变成CH(CH₃)CH₂CH₃，不仅体积变大，空间上也阻碍了伊马替尼的进入，而且失去形成氢键的能力(羟基O为氢键接受体)。化合物31对Abl^T315I激酶有中等强度的活性，提示该系列化合物的结构特征对门户残基的Abl变异仍可结合。进而设想将乙烯基换成直线型的乙炔基更能解除位阻效应。为此将乙烯基和乙炔基与有强结合作用的芳环进行组合优化。
化合物33与32比较(同样35与34相比)虽然对未变异的Abl的活性相近，但对变异的激酶活性(Abl^T315I)提高了30～40倍，这些结果说明乙炔基是优化的连接基。然而化合物33和35的药代动力学性质不佳，且很容易被代谢消除，须进一步优化。

3.4 骨架迁越——更换嘌呤环

嘌呤和苯环之间的连接基是N-C≡C-C的炔胺结构时，化学和药动学不如C-C≡C-C稳定，故试图变换嘌呤环结构，合成一系列新的化合物。

化合物36和37对Abl的抑制活性很高，证明了骨架跃迁的成功，但是大鼠的药代动力学不佳，可能是由于嘌呤环上的氨基或乙酰氨基导致的，故去掉氨基后，化合物38保持了对变异酶的活性，而且改善了大鼠药代，口服利用度42%。但Abl的活性弱于36和37。在咪唑环上加入助溶基团后，39和40的活性仍不高，还得以新的途径优化活性。
3.5增加与活化环套的结合——模拟伊马替尼的结构设计

在已有优化的基础上再提高与Abl^T315I酶的结合作用，探索增加与活化环套(A-loop)的残基结合。

合成化合物41的活性结果表明，对Abl^T315I激酶活性比38提高2倍，Abl提高20倍，而且在高浓度(340 μmol·L^-1)人血浆白蛋白存在下对白血病细胞抑制活性并不减弱，提示与血浆蛋白结合的较少，因而成为一个很好的突破口。若将哌嗪片段移至5位，活性减弱，提示位置的重要性。下一步优化碱性片段都在苯环的4位。

变换碱基片段的活性结果表明，化合物41的哌嗪N4被氧原子替换，吗啉化合物42活性显著减弱，佐证了N4形成氢键的重要性。43和44分别为缩环和扩环化合物，虽然也存在类似于哌嗪N4的氮原子，但这两个化合物的活性弱于41，将41的N-CH3换成较大的烷基或氟(或羟)乙基(48、49)都不利于抑制突变株。
3.6母核吡咯并吡啶的再检讨

当初去除氨基以改善药代效果时，虽然损失了一些活性（权衡结果划算），现为了弥补损失，合成了一系列增加杂环内的NH的衍生物，以提供氢键给体。

化合物52～55的活性表明，52和55对变异激酶的活性略有提高，但是53和54的活性降低。另一思路是，为了降低41的亲脂性(clogP=6.69)，在吡唑并吡啶环的不同位置加入一个氮原子(加一氮原子分配系数降低1个对数单位)，化合物57和58活性显著提高，尤其是57。56的低活性是由于杂环的8位是用氢键接受体占据了氢键给体的位置，从而发生互相排斥的缘故。58的大鼠药代优于57，下一步是对母核换作咪唑并吡啶后的继续优化。

3.7 新骨架的各取代基的综合调整以58为新一轮优化的起点，在苯环A的2位变换甲基，苯环B的3,4位变换三氟甲基和碱基，对结构进行微调，化合物及其活性如下：

得出还是化合物58的活性最佳。

3.8候选化合物的药代性质

化合物58胜出为候选化合物，与各个里程碑化合物作了药代动力学比较， 58大鼠灌胃的生物利用度18%，半衰期11h，静脉注射的清除率0.65 L·h^-1·kg^-1。58定名为帕纳替尼(ponatinib)，临床前和临床实验，表明对慢性粒细胞白血病和费城染色体阳性的急性白血病有效，于2012年经美国FDA批准上市。

小结

帕纳替尼是一个线型分子，它的研制涉及了整个分子所有的基团和片段的优化，虽然同类产品伊马替尼在它10年前面市，也在设计上有所借鉴，但仍不失为创新性药物。在分子设计−合成−评价−构效关系分析的循环反馈中，结构生物学、分子模拟和药物化学的交织应用与印证，对结构的各个侧面做到了精雕细刻的考察，甚至是反复地验证。

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