“一正一副二辅助”——用于疫苗和基因治疗的LNP的配方概述
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引言
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LNP的主要配方概述
LNP技术最早源于脂质体，如阿霉素脂质体（Doxil），经过20多年的研究，经历了脂质体（Liposome）、阳离子脂质（Lipoplexes），质粒脂质颗粒（stabilized plasmid-lipid particles ，SPLPs）改进和优化，最终在LNP技术平台上实现了高负电荷的核酸分子的封装和递送。（图一）
LNP技术具有稳定性好、毒性低，靶点部位高聚集的特点。通过分析发现：目前FDA批准的LNP配方均包含“一正一副二辅助”的脂质配方组合——
（1）“一正”即阳离子脂质；
（2）“一副”即聚乙二醇-脂质聚合物；
（3）“二辅助”即两种辅助的脂质胆固醇（cholesterol）和硬脂酰基磷脂酰胆碱（DSPC）。阳离子脂质、聚乙二醇聚合物、胆固醇和DSPC的摩尔比依次约为50:1.5：38.5：10。
LNP配方中包含多种脂质成分，这些不同的脂质成分对最终药物的大小、稳定性、核酸包封效率、细胞摄取和内涵体逃逸等方面具有不同的作用。本文将对目前临床和临床前研究中LNP技术中的不同脂质成分进行介绍。
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阳离子脂质——“可收可放的灵魂”
阳离子脂质可以说是整个配方中的“灵魂”，阳离子脂质通常包含有至少一个叔胺、至少三个烷基链和13个碳的长烷基链结构。叔胺基在中性条件下“质子化”，而在低于阳离子脂质pKa的pH条件下‘去质子化’，从而实现两个关键功能：（1）利用其正电荷的特性吸附核酸药物，实现核酸包封；（2）在药物入胞后介导内涵体逃逸，使得核酸可以释放到胞浆中。此外，阳离子脂质在调节细胞结合中也发挥着作用。
1正负电荷吸引，实现核酸封装
阳离子脂质带正电荷，通过正负电荷相互吸引的作用，吸引带负电荷的核酸聚合物磷酸主链，完成核酸药物的封装,实践操作中通常在显著低于阳离子脂质的表观pKa的酸性pH环境（<4）中条件下制备LNP，同时为了确保适当阳离子脂质“质子化”，通常还会使用适当pH的缓冲液来进行质子交换的调节。
2阳离子脂质的表观pKa调节LNP介导的高效基因转染
体内研究发现阳离子脂质结构的pKa是实现内涵体逃逸的重要因素。LNP在体内被会细胞摄取而后进入内涵体结构中，内涵体的低pH环境往往会将核酸破坏而失活，但具有适当pKa阳离子脂质在酸性环境中的‘去质子化’，实现内涵体逃逸，有效地介导基因转染。
在LNP配方中的阳离子脂质、两性离子DSPC和胆固醇，分别具有不同的化学结构，如叔胺、季氨基、带负电的磷酸盐和胆固醇中的羟基等，这些基团之间的相互接近，任一配方成分的改变都可以改变阳离子脂质整体的pKa，同时脂质结构中的碳链长度和空间结构也会影响阳离子脂质的pKa，这使得阳离子脂质的pKa的测定极为复杂。
以Onpattro为例，其中使用了表观pKa为6.44的DLin-MC3-DMA为阳离子脂质，而Moderna在mRNA-1273中合成并使用阳离子脂质Lipid—H（SM-102），其pKa是6.68。在后续的研究中发现，DLin-MC3-DMAc在mRNA的递送表现劣于Lipid—H，说明用于siRNA传递的LNP配方对其他核酸（如mRNA和DNA）并不适用。针对不同的核酸药物需要开发不同的阳离子脂质，这些都提高了LNP配方的开发难度。（图二）
3阳离子脂质与LNP免疫原性和毒性
阳离子脂质通常具有细胞毒性，在配方设计中必须考虑阳离子脂质的体内安全性问题。BNT162b2，mRNA-1273所使用的脂质在体内都可以被完全降解，Onpattro中应用的阳离子MC3阳离子脂质在虽然不能在体内的完全降解，但其降解的中间物也是体内原本就存在的。
相关研究表明，一些阳离子脂质可以激活toll样受体，从而诱导炎症细胞因子和共刺激分子生成。但诱导免疫刺激并不等于增加免疫原性，诱导免疫刺激和增加免疫原性的相关性还有很多需要了解的地方。但是目前需要注意的是在注射Onpattro之前，需要预先服用对乙酰氨基酚、糖皮质激素和H1/H2阻断剂以应对的输液过程中潜在相关免疫反应。
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PEG脂质的作用——“小而大的副手”
PEG脂质是由亲水性的PEG链和疏水性的烷基链/二烷基链组成的具有‘两亲性’的长链结构。尽管PEG脂质在LNP配方中所占的摩尔百分比最小（约1.5 %），但PEG脂质的含量和PEG脂质的结构和长度显著影响着LNP的粒径、制备和储存过程中的颗粒稳定性。此外，PEG脂质还影响核酸包封效率、半衰期、体内分布、转染效率和免疫反应等，其作用是仅次于阳离子脂质的存在，不可谓不大。（图三）
1PEG脂质与LNP的大小和稳定性
研究表明在LNP的配方中DSPC和胆固醇摩尔百分比对LNP大小的影响甚微，起主要作用的则是PEG脂质。用不含有PEG脂质的配方中制备的纳米粒的粒径达到200 nm左右，同时稳定性不佳，而只要含有0.5 mol%的PEG脂质，就可以产生稳定、均匀的粒径小于80 nm的LNP。
在LNP的制备过程中PEG脂质中具有亲水性部分的PEG链在LNP表面形成的亲水性立体屏障促进LNP自组装完成，PEG链从在新形成的纳米粒的表面延伸，形成的空间位阻减少纳米粒的聚集来提高整体的稳定性。如Moderna的mRNA-1273在-25到-15°C之间可以保存9个月，在2-8°C下可以保存30天；而Pfizer—BioNTech的BNT162b2在-90到-60°C可以保存9个月，2–8°C条件下1个月；Onpattro在4℃则可以保存36个月。
2PEG脂质介导LNP的靶向能力
聚乙二醇可以防止纳米颗粒在体内被快速清除和增加体内循环时间，促进药物在靶部位的聚集，通过调节不同的PEG脂质摩尔比可以调节LNP在相关细胞内传递其核酸药物的能力，但聚乙二醇的高稳定性的特点也限制了细胞相互作用，主要由于PEG脂质的疏水链（烷基/酰基链）也会并入LNP膜，导致PEG脂质不太可能从LNP解离，带来细胞摄取低和内质体逃逸差的问题，这通常被称之为“PEG困境”。
为了破解这一难题，Onpattro的配方中引入了PEG脂质是PEG-氨基甲酸酯-1,2dimyristoyl-sn-甘油（PEG-c-DMG）。通过静脉注射后，PEG-c-DMG更倾向于从LNP中解吸，使颗粒能够吸附载脂蛋白E，利用肝脏中特定细胞摄取途径提高摄取率。
综上所述，不同的PEG脂质控制这LNP的体内循环时间，影响LNP与细胞的相互作用。选择哪种PEG脂质主要取决于治疗目的、靶器官以及给药途径，同时还必须考虑PEG脂质的疏水链部分的摩尔比和长度。
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辅助脂质——“传统而日渐式微”
LNP技术最早是源于脂质体的研究中，辅助脂质在脂质体的研究中主要是起到提高稳定性，改善体内循环的作用。
在核酸递送的LNP配方中辅助脂质，是一类区别于阳离子脂质的中性脂质，包括甾醇、磷脂和甘油脂质等。他们通常是源于传统脂质体的辅助脂质配方，这些辅助脂质在LNP中的作用也与其在传统的脂质体中相类似。（图四）
1胆固醇
胆固醇细胞膜的组成部分，在传统的双分子层结构的脂质体中胆固醇与磷脂结合时，胆固醇可以促进其形成膜流动性低，厚度增加的双分子层结构。
在小分子药物脂质体的制备中，加入胆固醇的主要目的是：（1）在循环过程中介导细胞的内吞，（2）显著减少表面结合蛋白的数量，提高循环半衰期。
因此， LNP配方含中胆固醇的目的也是减少膜的流动性，保持膜的完整性。但在相关研究中证实，胆固醇在递送核酸的LNP配方中不会再是液体形式，高摩尔含量胆固醇的会导致在LNP核心中形成不溶性胆固醇微晶，进而导致阳离子脂质的“去质子化”。
2磷脂的作用
小分子脂质体配方中最常见的磷脂包括DSPC和1,2-二烯丙基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE），因为在传统的脂质体中需要一定液体—凝胶结晶相变温度高的脂质实现体内的长循环时间和高稳定性。但目前商业化LNP系统仅包括DSPC，可能是因为一方面DSPC已经得到了成熟的应用，另一方面是关于质粒DNA传递的研究中还显示：含DSPC的制剂显示出比含DOPE的系统更高的细胞摄取水平。
总体而言，辅助脂质在核酸输送系统中的摩尔比正逐步下降。在阿霉素脂质体中，DSPC的摩尔百分比为56%，胆固醇的摩尔百分比约为38%。目前商业化的LNP仅含有10 mol%的以DSPC，原因是递送核酸的LNP配方需要高比例的电离脂质（50 mol%）来结合和封装核酸药物。
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总结
目前用于核酸递送的商用LNP配方中主要由这四种不同的脂质成分构成的一套‘组合拳’，但任何阳离子脂质和聚乙二醇脂质的微小的物理化学及含量的变化都会对LNP结构产生大的影响。从事LNP临床转化领域的研究者也对复杂多变的LNP配方感到困惑，相关的临床试验也在失败中一步步前进。
这一领域还有许多的基础研究需要展开，如LNP摄取过程、内涵体逃逸机制、在靶器官部位富集以及LNP配方成分与免疫系统之间的相互作用等。
未来，大型计算机辅助分子动力学模拟研究、更先进的核磁共振或其他技术的升级可能会提供更多关于核酸药物和脂质配方在LNP中的详细的研究信息。通过合理的设计，可以进一步推动LNP的治疗研究。我们也期待在临床上看到更多、更成功的基于核酸的疫苗和疗法。
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