如何让多肽进入细胞？只需这四步！

来源：药渡

撰文：哥哈骎     编辑：安非他命

多肽口服递送的探索，早在上世纪80年代（1983）就已经通过cyclosporine A（图1）实现了历史性突破。这个天然多肽可以实现较高的口服生物利用度，因此被开发为口服制剂。

图1. Cyclosporine A化学结构

然而cyclosporine A的口服递送激发了人们对于口服多肽的开发热情，却没有将彻底打开口服多肽大门的钥匙完全呈递出来，人们对于多肽口服生物利用度的实现问题仍然在上下求索之中。除了多肽的稳定性，抵抗多种酶降解之外，如何实现穿越细胞膜也是研究的重点之一。来自瑞士ETH大学的研究者最近通过一个柔性的十元环肽（图2）进行了多肽穿越细胞膜的分子动力学模拟过程。

相对于过于柔性的直链肽，环肽具有所谓的“变色龙特性”（chameleonic behavior）。变色龙根据环境改变皮肤颜色，而环肽可以根据环境的极性改变分子构象。这种特性取决于环肽分子内氢键与分子间氢键的转化。

图2. 柔性十元环肽结构，来源: J Med Chem

在在研多肽药物所谓的“Open”构象中，面对极性环境（例如血液或细胞质中），环肽的可成氢键原子暴露出来，与溶剂中的对应物产生氢键，或者与极性溶剂分子形成氢键。但当环境变成非极性条件时（例如在细胞膜内部），环肽可以转而采取所谓的“Closed”构象，自己“卷而怀之”，通过形成分子内氢键，将极性基团包裹在分子内部，而将非极性结构暴露在分子表面，从而减小极性面积，降低去溶剂化能（desolvent energy, 指溶质从水或其他溶剂中移开时所需的能量）。环肽的这种变色龙属性对开发口服多肽制剂有所帮助，因为它可以平衡良好的水溶性和脂溶性，有利于增加细胞渗透性。

通常认为Closed状态是环肽的主要的渗透状态。但这是一个动态的过程，受到序列、分子大小、疏水表面积等多种因素的共同控制。研究者通过分子动力学模拟，将环肽分子通过被动渗透穿越细胞膜进入细胞内部的过程模拟出来，突出了柔性构象对于环肽膜渗透的重要性，并将其分为四个步骤（图3）：

• 特定的多肽侧链残基可以充当“分子锚”，在多肽分子插入细胞膜之前，作为“先遣部队”建立环肽与细胞膜的初次接触。

• 在“锚定”于细胞膜之后，多肽分子直接纵身跃入，将自身插入细胞膜极性头部（polar headgroup）和非极性尾部（unpolar tail）区域之间的界面处。在这个过程中，环肽展现出两种潜在的排列方向（orientation），Open状态采取了orientation A和B，更偏好orientation A。Closed状态的环肽只采取orientation B。

• Open状态向Closed状态转化，增加它渗透的机会。这时，多肽分子的变色龙性质对于他们从极性的环境中进入非极性环境就非常重要了。Open状态下的环肽很难实现接下来的扩散过程。

• 只有处在Closed状态的环肽分子，才有可能从细胞膜表面的这种极性/非极性“夷夏混杂“的环境，扩散通过非极性的脂质膜小叶上，并且扩散至另一侧的极性/非极性界面。通过锚定和翻转机制，实现最终的跨膜历程。

图3. 柔性环肽被动膜渗透的四个步骤，多肽为蓝色，膜显示为橙色。Closed构象的多肽由其分子内氢键（虚线）表示。将多肽锚定在膜上的侧链残基用锚定符号表示。疏水矩（hydrophobic moment）从分子的极性部分指向非极性部分。(图片来源：J. Med. Chem)

- 第一步 -

模拟分子动力学表明，Open构象和Closed构象环肽的锚定残基不同，这是由于在这两种构象中，残基的可接触程度是不一样的。鉴于氨基酸的锚定是依赖多肽构象，因此表征环肽的构象行为对于合理设计多肽药物至关重要。了解多肽在进入细胞膜之前的主要构象以及相应的残基暴露，将有助于优化膜渗透性环肽的设计。这种氨基酸残基侧链“锚定”引发膜渗透的模式，可以推广到多肽以外的其它分子模态，例如通过中度脂肪链缀合的方式可以增加分子的膜渗透性。

- 第二步 -

多肽插入膜中并使其自身平行于膜平面。如果插入发生在Open构象的分子中，则多肽可能采取两个排列方向A和B。而如果多肽插入是已经处于Closed构象（预折叠），则仅观察到排列方向B。这对于其它大环多肽的设计也有借鉴价值，尤其是那些具有连续疏水表面的多肽。只有orientation B有利于多肽从Open到Closed构象的转化。

- 第三步 -

构象的变化，从Open到Closed，这种变化对于接下来的膜内扩散是非常重要的。

- 第四步 -

进入细胞膜内的多肽分子必须扩到到膜的另一侧（下部小叶，lower leaflet）。而作为穿越膜的最后一步，多肽分子需要经历和第一步类似的过程，即其氨基酸残基需要锚定到lower leaflet的极性头部，而这一过程也涉及到了环肽的排列方向翻转，导致疏水矩（hydrophobic moment）的方向改变。

模拟表明，氨基酸（例如亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸）的影响可能与多肽序列高度关联，取决于氨基酸在肽中的位置以及其他残基的情况。这个对环肽渗透途径的分子动力学模拟，目标是提高多肽的生物可利用性，尤其是口服生物利用度，开发出更多可以通过口服递送的多肽药物。

参考资料：

1. Linker, S. M. et al. Lessons for Oral Bioavailability: How Conformationally Flexible Cyclic Peptides Enter and Cross Lipid Membranes. . Med. Chem. 2023. 66. 2773–2788.

专栏作者

哥哈骎

南开大学本科、硕士，德国比勒菲尔德大学博士。多肽化学、多肽API GMP生产专家、欧洲制药公司首席科学家；

拥有Lean Six Sigma黑带认证；

著有专著《Side Reactions in Peptide Synthesis》。

*声明：本文仅是介绍医药疾病领域研究进展或简述研究概况或分享医药相关讯息，并非也不会进行治疗或诊断方案推荐，也不对相关投资构成任何建议。内容如有疏漏，欢迎沟通指出！药妆多肽之神经递质抑制剂多肽的美容功效
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